過表達HMGA1 影響動脈粥樣硬化血管內皮細胞凋亡和p38MAPK 信號通路

朱沈輝 酈俊 （長沙市第一醫(yī)院急診科,湖南 長沙 410005）

動脈粥樣硬化（AS）是指主要發(fā)生在大中動脈管腔內的慢性炎癥及纖維增生性病變，是大部分心血管疾病的病理學基礎，具有高的發(fā)病率、致殘率和死亡率的特點，嚴重威脅人類的生命健康〔1，2〕。AS形成是一個復雜的過程，其中炎癥、氧化應激被認為是AS 的核心發(fā)病機制〔3，4〕。有研究表明，內皮細胞損傷是導致AS 和高血壓的一個關鍵因素〔5〕。因此，抑制由氧化應激引起的AS 血管內皮細胞損傷對于其治療具有重要意義。高遷移率族蛋白（HMG）A1 是一種非組蛋白性質的染色體蛋白，參與包括DNA 復制、轉錄、重組和修復等多種重要的生理功能調控，其中對基因表達轉錄調控尤為重要〔6〕。有研究表達，HMGA1 表達與糖尿病大血管病變形成有關〔7〕。此外，也有研究顯示，AS 斑塊中有HMGA1 蛋白存在，HMGA1 可通過調節(jié)CD44 參與AS 形成，是AS 病變發(fā)生發(fā)展過程的一個重要調節(jié)者〔8〕。目前關于HMGA1 對AS 血管內皮細胞生長影響尚未明確。本研究通過過表達人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）HMGA1 表達，旨在探討HMGA1 表達對H2O2誘導的HUVECs 增殖凋亡的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料方法

1.1 試劑和儀器 HUVECs 購自美國ATCC。DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco；Lopofectamine 2000 購自美國Invitrogen；MTT、DMSO 及SB203580 均購自美國Sigma；HMGA1、p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 抗體均購自美國CST；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；酶標儀購自美國Thermo；流式細胞儀購自美國BD。

1.2 研究對象 本研究所用AS 組織來源于長沙市第一醫(yī)院自2017 年1 月至2018 年1 月經(jīng)血管造影確診為AS 患者52 例，其中男28 例，女24 例，年齡51.9～78.2 歲，平均（67.1±11.1）歲。嚴格排除有糖尿病、心肌梗死病史及曾有心絞痛的AS 患者。上述AS 患者中的20 例，后期進行心血管手術切除斑塊組織時，同時切除正常血管組織作為自身正常對照（對照組）。組織采集后做好標記，即可放入液氮中保存。所有樣本的采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，并簽署知情同意書。

1.3 細胞培養(yǎng) HUVECs 在DMEM 培養(yǎng)基中（含10% FBS 及青霉素和鏈霉素），于5% 體積分數(shù)CO2、37℃及相對飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日換液，待細胞生長至融合時，按照實驗需要傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.4 實驗分組及處理 將生長至對數(shù)期的HUVECs細胞分為空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組。空白組細胞不經(jīng)特殊處理。H2O2組使用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細胞4 h。H2O2+NC 組和H2O2+si-HMGA1 組分別用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細胞4 h，再分別轉染pcDNA3.1 空載體及重組體pcDNA3.1-HMGA1 48 h。其中pcDNA3.1 的轉染參照Lopofectamine 2000 說明進行操作。

1.5 Western 印跡 采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法對蛋白進行定量。按照50 μg/孔等量上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、電轉移聚偏氟乙烯（PVDF）膜及封閉膜后，加HMGA1、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p-p38MAPK、B 淋巴細胞瘤（Bcl）-2 和Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體（稀釋比例1 ∶1000），4℃孵育過夜，次日，TBST 洗膜，加HRP 標記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜，電化學發(fā)光（ECL）顯色，顯影、定量。Quantity One 軟件進行灰度值分析。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH 灰度值。實驗重復3 次。

1.6 甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測細胞活力 以5×103個/孔接種HUVECs 細胞等量于96 孔板，按照1.4 分組處理細胞，處理結束后每孔中加入20 μl的MTT 溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉上清，加入150 μl/孔的二甲基亞砜（DMSO），搖床震蕩10 min，以使結晶能夠溶解充分。490 nm 波長下，酶標儀測定吸光度值（A）。以A 值衡量細胞的增殖活力。實驗重復3 次。

1.7 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡 收集按照1.3 分組處理后的細胞，制備成單細胞懸液，收集1×106個細胞。按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）雙染細胞凋亡試劑盒說明。預冷的PBS 洗滌細胞，然后用1×結合緩沖液重懸細胞。分別加入5 μl 的AnnexinV-FITC和5 μl 的PI，避光孵育10 min，1 h 內通過流式細胞儀檢測。實驗重復3 次。

1.8 制p38MAPK 信號對HUVECs 細胞活力和凋亡影響 使用5 mmol/L 的p38MAPK 信號通路抑制劑SB203580 處理HUVECs 細胞，細胞分為H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1組。通過MTT 法及流式細胞術分別檢測3 組細胞活力和凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 AS 組織HMGA1 表達 以正常血管組織作為對照，AS 患者斑塊組織HMGA1 表達（0.481 ±0.052）明顯高于對照組（0.046±0.006，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western 印跡檢測AS 患者斑塊組織HMGA1 表達

2.2 HMGA1 在H2O2誘導的HUVECs 細胞表達 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組HMGA1 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（0.711 ±0.058、0.053±0.006、0.074±0.009、0.335±0.026；F=271.396，P＜0.05）。與空白組比較，H2O2組和H2O2+NC 組HMGA1 表達明顯降低（P＜0.05），H2O2組和H2O2+NC 組間HMGA1 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與H2O2+NC 組比較，H2O2+HMGA1 組HMGA1 表達明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Western 印跡檢測H2O2 誘導的HUVECs細胞HMGA1 蛋白表達

2.3 HMGA1 表達對H2O2誘導的HUVECs 細胞活力影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組A 值差異具有統(tǒng)計學意義（0.806 ±0.062、0.432±0.038、0.424±0.035、0.671±0.056；F=43.758，P＜0.05），H2O2可明顯降低HUVECs 細胞活力，而過表達HMGA1 后細胞活力明顯升高（P＜0.05）。

2.4 HMGA1 表達對H2O2誘導的HUVECs 細胞凋亡影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義〔（2.47±0.34）%、（30.97 ± 1.65）%、（30.60 ±1.57）%、（15.77±1.01）%；F=284.271，P＜0.05〕。H2O2可明顯誘導HUVECs 細胞凋亡，而過表達HMGA1 后細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測過表達HMGA1 后HUVECs 細胞凋亡率

2.5 HMGA1 表達對H2O2誘導的HUVECs 細胞p38MAPK 信號通路影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組p38MAPK 蛋白表達分別為（0.682 ±0.058、0.662 ±0.054、0.691 ±0.059、0.690 ± 0.060），p-p38MAPK 蛋白表 達分別 為（0.023±0.005、0.134±0.015、0.148±0.016、0.078±0.010），Bcl-2 蛋白表達分別為（0.654 ±0.062、0.089±0.011、0.096±0.013、0.547±0.056），Bax 蛋白表達分別為（0.067±0.008、0.482±0.052、0.491±0.053、0.166±0.018），4 組的p-p38MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義（F=64.691、145.152、96.147，均P＜0.05）而p38MAPK 蛋白表達整體比較差異不顯著（F=0.163，P＞0.05），見圖4。H2O2可明顯上調HUVECs 細胞p-p38MAPK 和Bax表達，下調Bcl-2，而過表達HMGA1 后p-p38MAPK和Bax 表達明顯降低，Bcl-2 表達明顯升高（P＜0.05）。

圖4 Western 印跡檢測過表達HMGA1 后HUVECs 細胞p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達

2.6 抑制p38MAPK 信號通路對H2O2誘導的HUVECs 細胞活力和凋亡影響 H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1 組細胞A值（0.438±0.041、0.613±0.049、0.825±0.069），凋亡率〔（30.47±1.72）%、（17.03±1.21）%、（6.90±0.72）%〕 差異均 有統(tǒng)計 學意義（F=38.223、236.164，均P＜0.05），見圖5。與H2O2組比較，H2O2+SB203580 組細胞活力明顯升高，凋亡率降低（P＜0.05），與H2O2+SB203580 組比較，H2O2+SB203580+HMGA1 組細胞活力明顯升高，凋亡率降低（P＜0.05）。

圖5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

3 討論

血管內皮細胞功能異常與AS 發(fā)生發(fā)展密切相關，是AS 一系列改變的始動者〔9〕。活性氧是導致內皮損傷的一個主要因素〔10〕。H2O2是機體產(chǎn)生的活性氧，可通過對生物膜中多不飽和脂肪酸過氧化引起細胞損傷，最終導致AS 形成，并加重動脈狹窄及增加血管支架成型術后再狹窄發(fā)生率〔11〕。目前多項研究實現(xiàn)，H2O2可引起細胞內皮損傷、凋亡〔12〕。本研究也使用H2O2為處理因素建立血管內皮細胞損傷模型。HMG 家族在高等真核生物細胞核中廣泛分布，廣泛的參與多種重要的核內生物學功能調節(jié)，HMGA1 基因定位于人類第6 號染色體，其表達水平高低與多種腫瘤惡性程度密切相關〔13，14〕。最近的研究表明，HMGA1 表達減少被證實與2 型糖尿病發(fā)生及胰島素抵抗有關〔15〕。HMGA1 突變可增加胰島素抵抗及代謝性綜合征的風險，而糖尿病是導致AS 的重要危險因素之一〔16〕。HMGA1 在AS 中研究較少，已有研究表明，AS 中HMGA1 呈現(xiàn)陽性表達〔8〕。本研究通過H2O2刺激HUVECs 細胞，檢測HMGA1 過表達對細胞活力和凋亡影響，結果顯示，HMGA1 可明顯降低H2O2對HUVECs 細胞生長抑制和凋亡促進作用。提示HMGA1 對AS 具有保護作用。MAPKs 級聯(lián)是細胞內重要的信號轉導方式之一，在哺乳動物中廣泛存在，可將細胞外信號轉導至胞內，從而引起細胞增殖、凋亡、分化等生物學改變，對多種心血管疾病進展均發(fā)揮重要調節(jié)作用〔17，18〕。p38MAPK 是MAPKs 超家族成員之一，有研究表明，AS 形成過程與p38MAPK 信號激活存在密切關系，p38MAPK 信號通路的激活可促進VSMCs 增殖信號傳入細胞核，使其從中膜浸入內膜，并發(fā)生增殖，從而促進AS 的形成〔19，20〕。有研究顯示，使用p38MAPK 抑制劑SB203580 干預HUVECs 細胞，可明顯降低細胞凋亡率，上調Bcl-2 及下調Bax 表達〔21，22〕。Bcl-2 家族成員與細胞凋亡密切相關，Bcl-2 和Bax 分別為Bcl-2 家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，其比例可決定細胞是否發(fā)生凋亡。Bcl-2 表達升高，Bax 表達降低，可抑制細胞凋亡〔23，24〕。本研究結果提示HMGA1 可能通過抑制p38MAPK 信號對VSMCs 細胞損傷起保護作用。進一步研究表明，SB203580 可降低VSMCs 細胞增殖，抑制細胞凋亡，并增加HMGA1 對細胞增殖和凋亡的影響。說明HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號影響VSMCs 細胞生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1 在AS 斑塊組織高表達，HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號降低H2O2誘導的VSMCs 細胞凋亡，提高細胞增殖。提示HMGA1 可能是AS 治療的有效靶點之一。