基于PI3K/Akt 通路下調Smad7 對去勢骨質疏松大鼠的干預效果

劉超 王文靜 （中國人民解放軍陸軍第八十集團軍醫院,山東 淮坊 261000）

絕經后的女性，由于吸收速度大于骨的形成速度，兩者處于不平衡狀態，易導致骨質疏松（OP）〔1〕。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是傳遞重要信號的使者〔2〕。絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）是可調控細胞生長、代謝、增殖等功能的一種原癌基因〔3〕。Smad7 是一種參與轉化生長因子β 超家族細胞內信號轉導的抑制蛋白，其參與了細胞凋亡、免疫性疾病等病理生理進程〔4〕。表達異常的Smad7 蛋白通常會給機體帶來疾病，在去勢OP 模型大鼠成骨細胞中，下調Smad7 可促進細胞增殖和分化〔5〕。本文旨在研究基于PI3K/Akt 通路下調Smad7對去勢OP 大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料 40 只清潔級健康SD 雌性大鼠，鼠齡6～8 w，體重為220～260 g，均購自中山大學（實驗動物中心東校區），生產許可:SCXK（粵）2016-0029。大鼠分籠飼養，均在無約束進食及飲水環境下飼養。

1.2 OP 模型建立 從40 只大鼠中任意選取10 只為正常組，其余30 只參考胡倩倩等〔6〕OP 模型，具體操作:對大鼠進行6 h 的禁食，麻醉前將大鼠耳朵、尾部、脖頸部位固定，經大鼠腹腔使用0.3 ml/100 g戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）進行注射麻醉，注射10 min 后將大鼠以仰臥位固定在鼠板上，將大鼠的背部試驗區部位除毛，再用酒精（今勝化工有限公司）進行充分消毒，使用經過高溫消毒的醫用剪刀切開雙側第3 腰推背側正中皮膚，按照順序將肌肉、筋膜分離，將卵巢暴露出來，從輸卵管端將其結扎，將殘余組織歸納完腹腔后縫合切口，建立OP 模型，大鼠均全部建模成功。

1.3 大鼠Smad7 基因的干預及分組 Smad7 的siRNA，5＇-AACGAUCUGCGCUCGUCCGGCGUDTDT-3＇為正義鏈；3＇-DTDTUUGCUAGACGCGAGCAGGCCGCA-5＇為反義鏈。將所購買的Smad7 模擬物（Smad7 mimic，上調）、Smad7 抑制物（Smad7 inhibitor，下調）利用Lippofectamine 2000 試劑盒稀釋為5 mmol/L，將稀釋后的Smad7 模擬物、Smad7 抑制物分別注射于上調組、下調組大鼠胃組織中，空白組、模型組注射同劑量的蒸餾水灌胃，注射24 h 后觀察大鼠變化。轉染的前1 d，用不含血清和抗生素的高糖DMEM 代替培養液，待24 孔板內細胞融合至80%時，分別將Smad7 基因的siRNA 進行轉染，每只大鼠0.5 ml 腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液，均注射一次，14 d 后，對照磷酸緩沖鹽溶液及陰性siRNA，將建模大鼠隨機分為即去勢OP 組、上調組和下調組，正常組也給予等體積磷酸緩沖鹽溶液干預。轉染的濃度為50 nmol/L，待1 d 后進行糖氧剝奪（OGD）16 h。

1.4 Smad7 基因檢測 采用熒光定量PCR 檢測Smad7，用Trizol 的方法，提取所收集的細胞內總RNA，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。使用熒光定量PCR 儀（雅睿生物科技有限公司）檢測Smad7基因及內參GAPDH mRNA 表達，檢測試驗共重復3次，采用軟件Relative Quantification Study 定量分析。共干預12 w。

1.5 病理學觀察 股骨頭蘇木素-伊紅（HE）染色步驟:①固定大鼠的股骨頭于4%多聚甲醛溶液中。②取出固定的組織，使用手術刀將其切成厚度10 μm的樣品。③將樣品經乙醇梯度脫蠟至水，隨后放入Harris 蘇木素染4～10 min，用純凈水清洗。④迅速用1% 的鹽酸乙醇進行分色，置于純凈水10～20 min。⑤放入伊紅染液中染色3 min。⑥常規脫水后封片，于顯微鏡下進行觀察。

1.6 各組大鼠血清中鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）水平及股骨頭中骨密度（BMD）、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型前膠原氨基末端肽（PINP）水平比較 使用戊巴比妥鈉進行注射麻醉，取腹主動脈血2 ml，置于轉速為3 000 r/min 離心機中進行10 min 的離心處理。分離上血清，置于-80℃的環境中保存血清標本。采用全自動生化儀（海聚慕醫療，批準文號:豫械注準20182400088）檢測鈣、磷、ALP 水平:設置反應溫度、反應時間、主波長分別為37℃、8 min、600 nm，使用蒸餾水在實驗前為空白和標準品進行定標。將標準液稀釋為1 000 mg/L、600 mg/L、200 mg/L 3 個濃度，各檢測2 次取平均值。BMD、OCN、PINP 水平檢測:采用雙能X 線骨密度儀（圣迅醫療器械有限公司）測定BMD、OCN、PINP 水平，以仰臥位將大鼠固定在鼠板上，用70 和130 kV 開關脈沖穩定的雙輻射能量串行掃描大鼠股骨頭，分析掃描圖像得出BMD、OCN、PINP 水平。

1.7 各組大鼠股骨頭中磷酸化（p）-PI3K、p-Akt 蛋白水平比較 應用免疫蛋白印跡（WB）法測定。使用RIPA 緩沖液提取總細胞裂解物，配置含量12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE，恒壓80 V，2 h），將蛋白質分離后轉移到PVDF 膜，密封于5%脫脂奶粉中，并在4℃下與一抗孵育過夜。用緩沖液洗膜并作用15 min，重復3次。將膜與二抗孵育，于5℃中作用120 min，隨后涂上發光劑，曝光并掃描。采用Image J 軟件進行灰度分析。參照蛋白為β-actin。

1.8 統計學處理 采用SPSS20.0 軟件進行齊性方差、獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠Smad7 基因表達比較 與正常組（0.079±0.008）相比，去勢OP 組（0.210±0.012）、上調組（0.193±0.011）、下調組（0.097±0.013）Smad7 基因表達升高，具有統計學意義（P＜0.05）。與去勢OP 組相比，上調組、下調組Smad7 基因表達降低，具有統計學意義（P＜0.05）。與上調組相比，下調組Smad7 基因表達明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組股骨頭HE 染色觀察 如圖1 所示，正常組骨小梁間隙較大，骨小梁組織幾乎無損害；去勢OP 組骨小梁間隙小，結構不清晰，且骨小梁吸收慢或不吸收；上調組相較于去勢OP 組骨小梁間隙有所增大，骨小梁吸收變快但不明顯；下調組細胞質及細胞核顏色分明，骨小梁吸收程度較快，有骨密度升高的表現。

圖1 各組股骨頭HE 染色觀察(×200)

2.3 各組BMD、鈣、磷水平比較 見表1。與正常組相比，去勢OP 組、上調組、下調組BMD、鈣、磷水平均降低，具有統計學意義（P＜0.05）。與去勢OP組相比，上調組、下調組BMD、鈣、磷水平均升高，具有統計學意義（P＜0.05）。與上調組相比，下調組BMD、鈣、磷水平均明顯升高（P＜0.05）。

2.4 各組ALP、OCN、PINP 水平比較 與正常組相比，去勢OP 組、上調組、下調組ALP、OCN、PINP 水平均明顯升高（P＜0.05）。與去勢OP 組相比，上調組、下調組ALP、OCN、PINP 水平均明顯降低（P＜0.05）。與上調組相比，下調組ALP、OCN、PINP 水平均明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.5 各組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平比較 與正常組相比，去勢OP 組、上調組、下調組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均升高，具有統計學意義（P＜0.05）。與去勢OP 組相比，上調組、下調組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均降低，具有統計學意義（P＜0.05）。與上調組相比，下調組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 各組BMD、鈣、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比較(,n=10)

表1 各組BMD、鈣、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比較(,n=10)

與正常組相比:1）P＜0.05；與去勢OP 組相比:2）P＜0.05；與上調組相比:3）P＜0.05

圖2 各組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達

3 討論

OP 是一種以低骨量、骨骼微結構破損而出現的一種全身性骨病，其對骨骼的危害巨大，其致殘和致死是老年患者的主要原因之一〔7〕。目前影響OP 的因素較多，一部分人認為形態上的因素（形狀、物體受力等）、不正確的生活方式、影響骨代謝的藥物及疾病等可影響骨的形成和骨吸收，而大部分研究表明，OP 與遺傳、雌激素、營養情況有關〔8〕。絕經后OP 女性由于卵巢功能衰退、雌激素水平降低而減弱對破骨細胞的抑制作用，導致吸收速度大于骨的形成速度，使骨量降低且骨骼呈現細微結構破壞，而容易致使骨折〔9〕。在轉化生長因子（TGF）/Smad 蛋白活動信號通路中，Smad7 是其重要的成員，可抑制、調節多種細胞進程。鄧純博等〔10〕指出，Smad7 可以調節破骨和成骨細胞，介入骨骼重塑，而Smad7 本身也可調節絕經后OP。BMD 是表示骨骼強度的一個首要指標，其反映OP 水平，預判骨折的危險性〔11〕。鈣是一種銀白色的金屬元素，在骨骼中，鈣是以晶體的形式存在，占體重的2%。鈣作為生長發育必不可少的無機鹽，可擴張細胞的通透性、促進骨骼、牙齒的發育〔12〕。隨著年齡增長，女性絕經后體內的鈣營養被大量消耗、BMD 下降而導致OP〔13〕。在人體所有細胞中，都有磷的存在，幾乎所有生理上的化學反應都有磷的參與，它是骨骼的構成中不可或缺的材料，可調節體內酸堿平衡、參與人體代謝，而它的作用和活動能力需要維生素D 和鈣來維持〔14〕。本文研究中，下調Smad7 可促進BMD、鈣、磷水平，進而提高去勢OP 模型大鼠骨骼強度。

ALP 是一種經肝臟向膽外排出的糖蛋白，廣泛分布于骨骼、肝臟等組織內，是反映骨變的重要指標〔15〕。OCN 是一種維生素K 依賴性鈣結合的蛋白質，在骨組織內，其是非膠原蛋白主要成分。OCN在骨鈣代謝的調節中有著重要用途，由成牙質細胞、成骨細胞等合成，反映了骨代謝的總體水平〔16〕。在骨代謝指標中，PINP 可評價骨量、預測OP 的出現，且有較高的特異性和敏感性〔17〕。Akt 是一種含有480 個氨基酸殘基的蛋白激酶，可保護細胞使其不受凋亡的影響〔18〕。PI3K 在膜轉運、信號傳導及代謝的過程中有著重要作用，可調節癌癥、機體衰老、生物學細胞、組織〔19，20〕。PI3K 通過磷酸化Akt 激活增強雷帕霉素靶體蛋白，使腫瘤抑制基因生成磷脂酰肌醇2 磷酸，進而傳遞細胞的分化、增殖和遷移〔21〕。本研究結果提示下調Smad7 可改善去勢OP模型大鼠骨代謝。綜上所述，通過下調Smad7 可提高去勢OP 模型大鼠BMD、鈣、磷水平，降低去勢OP模型大鼠ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平，增強大鼠骨骼強度，調控骨代謝，其作用機制可能與PI3K/Akt 蛋白有關，為其臨床應用提供理論依據。