CAR-T細胞治療實體瘤的脫靶效應及優化方略①

彭燦燦 王惠明

（武漢大學人民醫院腎內科，武漢430060）

2017年以來，美國食品藥品監督管理局接連批準諾華公司的嵌合抗原受體T 細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）細胞產品CTL019 和Kite 制藥的Yescarta（KTEC19）上市，CAR-T 療法開始出現在大眾視野，并逐漸成為最具前景的腫瘤治療方式之一。近年CART在血液系統腫瘤治療，尤其是靶向CD19 CAR-T在急性難治型淋巴細胞白血病治療中，取得了矚目成就［1］。但CAR-T 在實體腫瘤方面卻鮮有實質進展，可能與脫靶效應、歸巢及T 細胞耗竭等有關。本文結合近年實體瘤相關研究，就CAR-T 細胞治療實體瘤脫靶效應進行綜述，并提出優化方略。

1 脫靶效應概念及產生原因

腫瘤抗原根據其特異性可分為：腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen，TSA）和腫瘤相關性抗原（tumor-associated antigen，TAA）。腫瘤表面腫瘤特異性抗原較為缺乏，CAR-T 靶向的多為腫瘤相關性抗原，因此，CAR-T 在識別殺傷腫瘤細胞同時，損傷低表達靶抗原的正常組織，產生脫靶效應，嚴重可危及患者生命。2010年，MORGAN 等［2］設計靶向ERBB2 CAR-T 治療結腸癌患者，患者于輸注CAR-T 5 d后出現進行性低血壓和心動過緩，隨后死于心臟驟停，為CAR-T識別并攻擊低表達ERBB2的肺上皮細胞所致。因此，脫靶效應在CAR-T 細胞治療實體瘤中備受關注。

2 克服CAR-T 細胞治療實體瘤脫靶效應的研究進展

2.1 尋找合適的腫瘤相關性抗原 目前發現的腫瘤特異性抗原較少，EGFRvⅢ（EGFR 受體突變體）作為少有的腫瘤特異性抗原，可被CAR 精準識別，在膠質母細胞瘤治療中顯示出較好療效［3］。而腫瘤相關性抗原則較多，間皮素（mesothelin，MSLN）可用于惡性間皮瘤、胰腺癌等治療，神經節苷脂2（GD2）可用于神經母細胞瘤等治療，人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）可用于乳腺癌治療等，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）可用于胃腸道腫瘤和部分腺癌治療，前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）可用于前列腺癌治療等。實體腫瘤具有高度異質性，即使在同一腫瘤病灶內，單一腫瘤相關性抗原也無法覆蓋所有腫瘤細胞，另外腫瘤相關性抗原在正常組織表達引起CAR 識別殺傷可能導致災難性脫靶毒性，因此，選擇合適的腫瘤相關性抗原至關重要［4］。理想的腫瘤相關性抗原應100% 表達于腫瘤細胞，同時應保證在正常組織上不表達或低表達，若低表達于心臟、肝臟、肺臟等重要器官可能引發嚴重后果［5-6］。尋找合適的腫瘤相關性抗原需要在CAR 殺傷腫瘤細胞效力和對低表達靶抗原的正常組織導致脫靶毒性間獲得最好的平衡，力求對重要臟器損傷達到最小且不影響靶向殺傷腫瘤細胞。

2.2 靶向腫瘤特異性糖基化位點 CAR-T 多數靶向腫瘤相關性抗原，腫瘤細胞和正常組織均有表達，不可避免出現脫靶毒性，除少有的特異性抗原EGFRvⅢ（EGFR 受體突變體）外，腫瘤特異性的糖基化靶點也是免疫治療的理想靶點。

黏蛋白1（Mucin1，MUC1）是一種大分子跨膜糖蛋白，在多種腺癌中高表達，包括胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌等惡性腫瘤，且相對于正常細胞，腫瘤細胞表面MUC1 錯誤表達為糖基化異常。以MUC1 為靶點，構建靶向MUC1 的CAR-T 細胞，體外實驗中分別檢測對肝癌細胞和正常組織的靶向殺傷作用，結果發現靶向MUC1 的Jurkat CAR-T 細胞可特異性殺傷MUC1 高表達肝癌細胞，為靶向腫瘤特異性糖基化位點MUC1 的CAR 修飾患者原代T 細胞用于肝癌臨床治療提供可靠依據［7］。POSEY等［8］發現，T 細胞白血病和胰腺癌異種移植模型中，抗Tn-MUC1 CAR-T 細胞具有靶向細胞毒性，并成功控制腫瘤生長，證明了靶向Tn-MUC1的CAR-T 治療效果，并提出了異常糖基化抗原可作為工程化T 細胞治療腫瘤的新靶點。

2.3 “邏輯門”設計

2.3.1 雙特異性CAR CAR-T 療法在臨床應用應嚴格確保其安全性，僅高于正常組織表達的單一靶抗原顯然無法滿足其安全性要求，因此另一種解決脫靶效應的方法應運而生。

將靶向2種不同抗原的scFv分別與激活信號和共刺激信號連接，識別第一抗原的scFv 與激活信號相連，識別第二抗原的scFv 與共刺激信號相連，CAR-T 細胞僅能靶向識別同時表達這2 種抗原的組織或細胞（圖1），增強其特異性，從而避免脫靶效應［9］。 WILKIE 等［10］設計出 靶向 乳腺癌2 種 抗原ErbB2 和MUC1 的雙特異性CAR-T 細胞，結果發現，靶細胞共表達ErbB2 和MUC1 下T 細胞才能有效殺傷腫瘤細胞并擴增，且對僅表達單一抗原的細胞無影響。動物實驗中有用于T 細胞活化識別的第一抗原Meso，也有用于T 細胞共刺激識別的第二抗原FRa［11］。

圖1 雙特異性CAR作用機制模型［9］Fig.1 Model of bi-specific CAR action mechanism［9］

2.3.2 iCAR 免疫檢測點如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）、細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）、B 和T 細胞衰減器（B and T cell attenuator，BTLA）等分子在正常情況下可競爭性抑制T 細胞活化及其他功能，同時在腫瘤組織中可能被用于誘導免疫逃逸，近年受到廣泛關注［12-13］。

CAR-T 細胞對靶抗原表達的腫瘤組織和正常組織均有殺傷作用，一種可供選擇的解決方法是應用iCAR［9］。iCAR 是在原有CAR 基礎上合成的抑制性CAR，不同于雙特異性CAR，合成的抑制性CAR識別腫瘤細胞表面TAA 的同時，其表面抑制性受體可識別存在于正常細胞而腫瘤細胞中不存在的抗原（圖2），既保證對腫瘤的正常靶向殺傷作用，也保護正常細胞免受CAR-T 細胞靶向損傷，FEDOROV等［14］通過構建胞內域抑制性分子PD-1 或CTLA4 受體的iCAR驗證此方法可控制CAR-T活化及應答。

圖2 iCAR作用機制模型［14］Fig.2 Model of iCAR action mechanism［14］

2.3.3 SynNotch 受體 另一種有效增強治療性T 細胞靶向性的方法是合成Notch 受體（SynNotch 受體），ROYBAL 等［15］構建1 個組合激活的T 細胞回路，其中識別1個TAA 的合成Notch 受體誘導第2個TAA 的CAR 表達，這些雙受體“AND”邏輯門控T 細胞僅在雙抗原腫瘤細胞存在下才被激活（圖3）。Notch 信號通路是癌癥中最常激活的信號通路，是癌癥治療與研究的新靶點［16-17］。

圖3 SynNotch受體作用機制模型［15］Fig.3 Mechanism model of SynNotch receptor［15］

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）同質性表達于卵巢癌、乳腺癌、肺腺癌，在一些正常組織如甲狀旁腺、胰島、食管部分區域、胃和十二指腸也有表達［18］。SRIVASTAVA 等［19］設計靶向ROR1 的CAR-T細胞表達針對腫瘤抗原EpCAM 或B7-H3 的Syn-Notch 受體，該抗原表達于腫瘤細胞而非基質細胞，結果表明B7-H3 更適合于臨床SynNotch 靶點應用，邏輯門控應用為CAR-T 細胞治療實體瘤拓寬了道路。

2.4 導入自殺基因 目前基因治療中常用的自殺基因包括單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）基因、誘導凋亡相關基因caspase-9（iCasp9）和EGFRt 基因。 iCasp9 和EGFRt 基因是人源性蛋白，二者免疫原性較低，而HSV-TK 免疫原性較高。HSV-TK 可磷酸化特定核苷類似物，如鳥嘌呤核苷類似物更昔洛韋（GCV），形成三磷酸產物并結合至DNA，導致抑制DNA合成并導致分裂的細胞死亡（圖4A）［20］。HSV-TK多用于控制移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD），療效較好，但其缺陷性在于HSV-TK免疫原性導致正常免疫系統消除轉導T 細胞，以及臨床上出現與使用前藥GCV 進行治療不相容現象，導致轉導T 細胞不必要消除［21-22］。iCasp9 系統包括iCasp9基因和化學誘導二聚反應（CID）藥物。iCasp9 基因與來自人FK506 結合蛋白的藥物結合域融合，AP1903可使該融合蛋白藥物結合區交聯，激活下游caspase-3 分子，導致細胞凋亡（圖4B）［23］。WITTE等［24］將iCasp9M 安全開關用于誘導糖尿病小鼠細胞治療發現，由于iCasp9 系統可直接激活效應者半胱天冬酶如caspase-3，7，9，相較于其他系統，iCasp9系統可更為快速地消除T 細胞，因此這個開關的觸發可有效阻止正在進行的、有致命風險的自身免疫攻擊。 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）廣泛分布于人體細胞表面，WANG等［25］通過逆轉錄病毒將人EGFR 多肽轉染至CAR-T細胞膜，當發生不良反應時，采用西妥昔單抗可消除轉染的CAR-T細胞（圖4C）。相對于基于CD20表達及利妥昔單抗應用的方法，此法不會引起正常B細胞消除。

圖4 3種自殺基因作用機制模型［16］Fig.4 Three models of action mechanism of suicide genes［16］

2.5 腫瘤細胞內抗原外表達 尋找新型腫瘤特異性抗原對于CAR-T 細胞成功治療實體腫瘤至關重要，腫瘤特異性抗原分布于細胞表面或細胞內，有研究提出，既然腫瘤細胞表面特異性抗原較為缺乏，可轉向應用腫瘤細胞內特異性抗原，且多種腫瘤細胞內的抗原屬于腫瘤特異性抗原。

細胞內抗原加工提呈給免疫系統主要通過MHCⅠ類途徑，又稱胞質溶膠途徑：細胞中產生的內源性抗原在蛋白酶體及其他蛋白水解酶下降解，產生適合與MHCⅠ類分子結合的短肽，抗原加工相關轉運蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）將內源性Ag 肽從蛋白酶體轉運至內質網（ER），鈣網蛋白參與下內質網中的MHCⅠ類分子荷肽轉運至細胞表面，被CD8+Tc 識別殺傷（圖5）［26-28］。荷肽復合物（peptide-loading complex，PLC）包括TAP、TAP 相關蛋白、MHCⅠ、ERp57 和鈣網蛋白，PLC 確保MHCⅠ類分子負荷有效的抗原肽，另外內質網氨肽酶相關處理（ER aminopeptidase associated with antigen processing，ERAAP）可能也參與多肽加工處理使其適于MHCⅠ類分子負荷，而這些因子在細胞暴露于IFN-γ時表達上調［29］。

圖5 基本的MHCⅠ類抗原呈遞途徑［26］Fig.5 Basic MHCⅠantigen presentation pathways［26］

GERBER 等［30］也提出胞內靶抗原表達的金標準尚不統一，HLA 提呈胞內抗原表位密度遠低于細胞表面抗原密度以及需要一系列加工才能與HLA復合物結合等問題為未來選擇性腫瘤特異性、胞內靶抗原應用提供了方向。

2.6 單克隆抗體封閉靶抗原 向患者輸注提前設計好的CAR-T 細胞前，采用針對該TAA 的單克隆抗體預先封閉正常組織低表達靶抗原，可有效減少后續治療中可能出現的脫靶效應。LAMERS等［31］設計靶向CAIX 的CAR-T 細胞治療轉移性腎細胞癌患者，將接受CAT-T 細胞治療的患者分為3組，為管理患者脫靶毒性，輸注CAR-T 細胞前3 d 向其中一組的4 位患者靜脈注射抗CAIX 單克隆抗體G250，隨后輸注CAR-T 細胞，立即監測肝臟活性，該組患者并未觀察到肝臟毒性，但該方法能否用于其他CAIX靶向正常組織導致的脫靶毒性仍需進一步研究。

2.7 親和力轉變 當二價配體的2 個藥效團同時結合至其靶位時，其表現出顯著親和力和靶停留時間增加，由于1 個藥效團結合迫使第2 個保留的藥效團靠近其相應位置；此外，這種“強制接近”產生局部高濃度的游離藥物團也將顯著增加其再次與原靶點結合的機會，引發“重新綁定”［32］。采用二價配體結合特性可幫助優化腫瘤抗原靶向性，同時保留低靶向性的正常組織。

CD38 在所有多發性骨髓瘤（MM）細胞呈高表達，但在一些造血細胞上呈中等水平表達，包括自然殺傷細胞、單核細胞和小部分T 細胞。DRENT等［33］提出一種新的可行的技術產生一群具有不同親和力的抗體，通過系統分析篩選出合適的單鏈抗體使CARs 可有效靶向腫瘤，而脫靶效應較小或沒有，證明單鏈抗體可選擇性靶向TAA，如MM 的CD38，且對靶抗原具有最佳親和力。

2.8 其他 改變T細胞輸注途徑，如胸膜內注射靶向間皮素的CAR-T 細胞治療惡性胸膜腫瘤，顱內注射治療多形性膠質母細胞瘤，瘤內注射使多數CART 細胞聚集于病灶范圍內，強化治療效果，同時限制其對正常組織的靶向毒性［34-35］；mRNA 電穿孔技術用于CAR-T 細胞基因轉導，CAR 瞬時表達，可較好調控治療過程中的不良反應［36］；控制CAR-T 細胞輸注劑量，通常CAR-T 細胞劑量與毒性呈正相關，應謹慎選擇首次治療的CAR-T 細胞劑量，臨床治療中可平穩提高輸注劑量；通過感知腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME），如缺氧和酸性環境等，使CAR-T 細胞僅能在腫瘤位點激活，進而殺傷腫瘤細胞，提高CAR-T 安全性；脫靶毒性往往與各種細胞因子釋放密切相關，臨床上避免脫靶效應產生的同時也需要重視對細胞因子釋放綜合征的治療。

3 結語

近年CAR-T 療法在血液系統治療中取得了良好療效，研究者堅信其在實體瘤治療中同樣具有巨大潛力。實體腫瘤高異質性及腫瘤特異性抗原缺乏導致CAR-T 細胞治療實體瘤中出現的脫靶效應是其應用中的較大障礙。避免脫靶效應產生有2個思路：一是增強CAR-T 對腫瘤細胞的靶向性；二是抑制CAR-T 靶向殺傷正常細胞。目前提出的針對脫靶效應的優化策略多基于動物實驗，很難在人體中完全再現，從臨床前試驗到臨床應用過程漫長而艱辛。雖然這些策略可能存在不足，需要改進或優化，但課題組相信隨著免疫學技術不斷發展，下一代CAR-T 細胞可表現出更優越的安全性和有效性，脫靶效應及其他毒副反應發生率將不斷降低，必將給實體腫瘤患者帶來希望。