膽道系統惡性腫瘤免疫治療的研究進展及展望①

甄自力 沈哲民 孫培龍

（復旦大學附屬金山醫院普外科，上海201508）

膽道系統惡性腫瘤（biliary tract cancers，BTC）是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，可發生于肝內膽管、肝外膽管等不同部位，主要包括肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）。其中，ICC 是僅次于肝細胞性肝癌的第二大原發性肝癌，發病率約占原發性肝癌的10%～15%，近年來發病率不斷上升，ICC起病隱匿，發病時已處于晚期，因此其惡性程度及死亡率較高，但由于近年醫療水平的提高，對ICC的治療效果有了一定的改善［1-2］。治愈BTC 的主要治療方式是完全切除腫瘤或進行肝移植，但即使采取這些積極干預的方法復發率仍高達50%［3］。同時，絕大多數BTC 患者在明確診斷時已進入晚期階段而無法進行手術干預，未經治療的中位生存期為3～6 個月，五年生存率為5%～10%［4］。在現行的診療標準下，這些晚期患者在接受最佳治療方案后中位生存期仍小于1年［5］。因此，探尋能夠針對BTC 有效的新的治療方法至關重要。

近年來，惡性腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域的一個重大突破，并且已被證明可通過誘導自身免疫系統攻擊腫瘤細胞，達到有效治療耐藥性實體惡性腫瘤（如非小細胞肺癌、黑色素瘤等）的效果［6］。作為炎癥相關性腫瘤，BTC 的免疫抑制微環境能夠通過多種機制促進免疫耐受和免疫逃避，但許多研究表明免疫治療仍存在成功治療的機會［7］。因此，誘發更加強烈的特異性免疫應答是針對BTC 的一種有效的治療策略。本綜述將回顧免疫檢查點阻斷、腫瘤疫苗和過繼性T細胞轉移等BTC免疫學治療的最新進展，并討論BTC 免疫療法的潛在進展及挑戰。

1 惡性腫瘤的細胞免疫反應

正常人體的免疫反應可以保護機體免受腫瘤或外來病原體的侵害，同時維持自身適度的免疫耐受防止發生自身免疫性疾病，其中，免疫反應包括固有免疫反應和適應性免疫反應。先天性免疫反應在病原體侵入機體后數分鐘到數小時內迅速發生防御反應，主要效應細胞包括自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell）、粒細胞、吞噬細胞等。特異性適應性免疫應答主要是通過樹突狀細胞（dendritic cell，DC）提呈抗原，從而刺激T 細胞成熟并募集其對腫瘤細胞或外來病原體進行靶向破壞，同時形成免疫記憶（圖1）。

圖1 固有免疫反應和適應性免疫反應Fig.1 Innate immune response and adaptive immune response

在某些惡性腫瘤發生過程中，免疫系統可識別出其由于基因表達異常所產生的腫瘤抗原，在早期將腫瘤細胞清除從而抑制疾病發展。然而，具有免疫抑制或免疫逃逸特性的BTC 等惡性腫瘤可通過積累免疫抑制細胞群、呈遞有缺陷的抗原、激活抑制性受體-配體通路等機制促進其發生發展［8］。此外，BTC 及其周圍的細胞因子、胞外基質、免疫細胞等構成一個具有復雜功能網絡的免疫微環境，通過分泌細胞因子或信號傳導抑制該部位免疫反應，從而達到驅動免疫逃逸的作用［9］。

2 免疫檢查點阻斷

免疫檢查點是一類細胞膜表面的特定受體，細胞間受體相互作用可抑制免疫反應，而阻斷免疫檢查點能夠使免疫細胞得到激活，增強抗腫瘤免疫反應，可作為惡性腫瘤免疫逃逸的關鍵調節位點。其中，程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）及其配體（programmed cell death ligand-1，PD-L1）、細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴細胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）和T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin，TIM-3）等免疫檢查點在BTC 免疫治療中發揮重要作用（圖2）。

圖2 免疫檢查點阻斷作用機制Fig.2 Mechanism of immune checkpoint blockade

2.1 PD-1/PD-L1 PD-1 是一種表達于活化的CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK 細胞上的一種免疫球蛋白超家族抑制分子，在維持免疫耐受和抑制T細胞的細胞毒性中發揮重要作用，PD-1與PD-L1結合可抑制T 細胞的活化并導致其凋亡，在免疫應答中發揮負性調控作用［10］。此外，PD-L1 不僅可以在CCA 腫瘤細胞表達，還出現在腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）細胞膜表面，腫瘤細胞與TAM 上的PD-L1 同時與CD8+T 細胞上的PD-1 結合進一步促進了CD8+T 細胞凋亡和免疫逃逸反應，為腫瘤的進一步生長鋪平了道路［11］。BTC 患者體內PD-1+CD8+T 細胞表達量增加不僅預示著腫瘤細胞具有更強的侵略性，也表明患者生存率較低、預后較差。

對ICC 組織免疫組化染色發現，PD-1/PD-L1 可在腫瘤細胞和炎癥細胞聚集物中表達。此外，PD-1/PD-L1上調的腫瘤通常與預后較差的不良事件發生相關，表明這些腫瘤可能是成為檢查點阻斷劑進行治療的靶點。有研究表明，在ICC 切除樣本中有72% 的腫瘤細胞樣本表達PD-L1，與PD-L1 陰性相比較，陽性患者的總生存時間明顯降低。盡管單獨的PD-1 或PD-L1 表達與臨床結局無關，但與PD-L1高表達或HLA Ⅰ類抗原低表達的患者相比，低表達的PD-L1 和高表達HLA Ⅰ類抗原的患者總生存時間更長［12］。這些研究為研究BTC 的PD-1/PD-L1 表達對預后的影響提供了理論依據，也為將來評估BTC的檢查點抑制療法的實用性奠定了基礎。

在臨床方面，一項針對BTC 晚期患者應用PD-L1 抑制劑治療的臨床研究表明，檢查點抑制劑治療耐受性良好，具有較好的抗腫瘤活性，總體緩解率為17.4%［13］。此外，BTC 中一部分人群是由于錯配修復缺陷而導致腫瘤發生，而作為PD-1抑制劑的派姆單抗（Pembrolizumab）能夠對錯配修復缺陷腫瘤有持久的反應，這為錯配修復缺陷致BTC 提供了新的治療思路［14］。目前，多項Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗正在評估聯合檢查點抑制劑療法對晚期BTC 的影響，在很大程度上有助提高BTC的治療效果。

2.2 CTLA-4 CTLA-4是一種表達在活化T細胞上的抑制受體，主要存在于調節性T細胞，其競爭性結合抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）上CD28 的配體CD80 和CD86。CTLA-4 抑制劑使得其無法競爭性抑制APC 和T 細胞結合，導致免疫反應可以正常進行。CTLA-4 被證明在多種腫瘤中具有抑制腫瘤相關性抗原（tumor associated antigen，TAA）的識別和細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的增殖的效應［15］。

有研究表明，CCA 患者體內CLTA-4 表達水平與腫瘤浸潤淋巴細胞數量呈負相關，低表達CLTA-4與總生存時間延長以及無瘤生存密切相關［16］。這證明了CTLA-4 的表達對BTC 患者預后具有顯著影響。

靶向CTLA-4 的抗體的許多臨床試驗正在進行中。CTLA-4 抗體替西木單抗（Tremelimumab）應用于CCA 患者的臨床試驗表明其抗腫瘤效果明顯，同時未發生免疫相關的不良事件，接受CTLA-4 抗體治療患者的中位生存時間和總生存時間均高于未接受者，同時6 周后活檢發現腫瘤浸潤CD8+T 細胞明顯增加，提示該方法有持久的抗腫瘤免疫反應。

3.3 LAG-3和TIM-3 LAG-3是免疫球蛋白超家族蛋白中的成員，通常能夠與Ⅱ類MHC分子高親和力結合，從而抑制T細胞的共刺激作用［17］。臨床上，正在Ⅰ期試驗（NCT01968109）中測試抗PD-1 聯合LAG-3對免疫檢查點的雙重阻斷。

TIM-3 是一種表達在分泌IFN-γ 的輔助性T 細胞，NK 細胞和CTL 上的跨膜蛋白可與可溶性配體galectin-9 相互作用，從而負性調控T 細胞反應抑制腫瘤免疫應答［18］。在慢性HBV 感染患者體內T 細胞浸潤伴隨TIM-3 表達增加，且TIM-3/galectin-9 途徑表面的存在HBV相關BTC患者預后較差［19］。

3 腫瘤疫苗

隨著越來越多的TAA 得到明確，針對腫瘤的疫苗也得到廣泛關注與研究。通過使用全細胞疫苗、抗原特異性肽疫苗或搭載抗原的樹突狀細胞疫苗，機體免疫系統識別腫瘤特異性抗原并對其敏感性升高，使得機體可以快速產生適應性免疫應答以識別和消除腫瘤細胞。

在BTC 相關性抗原中，Wilm 腫瘤蛋白1（Wilm's tumor protein 1，WT1）和黏蛋白1（mucin protein 1，MUC1）受到了密切關注［20］。多種惡性腫瘤中可以檢測到WT1 和MUC1 突變，該突變與預后不良和藥物耐受性密切相關。研究表明，80%BTC 患者體內出現WT1 突變，90%BTC 患者體內MUC1 過表達，并認為與中位生存期縮短顯著相關［21-22］。

一項藥物臨床研究中，8 名BTC 患者應用WT1肽疫苗聯合吉西他濱（Gemcitabine）治療，這8 例患者耐受良好且未出現劑量毒性反應。疫苗接種后，觀察到50% 的BTC 患者出現2 個月的病情穩定期，且總生存時間達到288 d，65% 患者體內可檢測到WT1特異性T細胞［23］。另一項藥物臨床研究中，8例BTC 患者應用MUC1 肽疫苗治療，由抗MUC1 抗體介導了特異性腫瘤免疫反應，結果顯示患者均耐受良好，但其中7例患者病情仍處于進展期［24］。此外，有研究表明，應用5-氟尿嘧啶、Gemcitabine 或IFN-γ治療可增加ICC 細胞中WT1 和MUC1 抗原的表達，該結果為腫瘤免疫的聯合療法提供了依據［25］。

除了針對WT1 和MCU1 抗原的腫瘤免疫疫苗研究，多個肽抗原聯合的疫苗也逐漸在BTC 中受到關注。對9例無法手術的晚期BTC 患者進行淋巴細胞抗原6 復雜基因位點K、TTK 蛋白激酶、胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白3和含DEP結構域的蛋白質1 的四肽疫苗治療，其中78% 的患者觀察到特異性T 細胞應答，除了在接種部位皮膚出現二型超敏反應外，無進展生存期和中位生存時間也顯著延長［26］。此外，該研究團隊進行了細胞分裂周期相關蛋白1、鈣黏蛋白3和驅動蛋白家族成員20A 三肽聯合的腫瘤疫苗免疫治療，參與治療的9 例患者均出現特異性T 細胞應答，5 例患者疾病出現穩定期，但總生存時間僅9.7個月［27］。雖然接受腫瘤疫苗治療的患者中位生存期無根本性的改變，但特異性T 細胞應答反應預示著腫瘤疫苗的有效性。

應用搭載抗原的樹突細胞疫苗同樣可以激活、上調T 細胞反應（圖3）。DC 作為最重要的APC，在激活幼稚T細胞和調節初次免疫反應中發揮關鍵作用，同時誘導產生抗腫瘤T 細胞免疫反應。將WT1和MUC1 抗原搭載于樹狀細胞疫苗用于治療65 例無法手術或復發的BTC 患者，其中發熱患者的總生存時間明顯改善，提示免疫應答有益于患者預后［28］。

圖3 搭載抗原的樹突細胞抗腫瘤疫苗作用機制Fig.3 Mechanism of anti-tumor vaccine of dendritic cells carrying antigen

4 過繼T細胞轉移

過繼T細胞轉移免疫治療即通過輸注患者自身的腫瘤浸潤淋巴細胞增加腫瘤特異性免疫反應和腫瘤內T細胞浸潤。與腫瘤疫苗誘導的免疫應答相比，過繼T 細胞轉移增加了腫瘤微環境中活化的CTL細胞的數量，從而形成更強的腫瘤免疫應答。

許多案例證明了過繼T細胞轉移治療對BTC的有效性。有病例報道了1例CCA廣泛轉移的患者在進行自身特異性反應性T細胞擴增并轉移后出現長達7 個月的無瘤生存［29］。表明過繼T 細胞轉移治療的可行性，作為ICC術后的輔助治療方法，36例患者納入了前瞻性臨床試驗進行活化的T 細胞轉移，同時應用搭載抗原的樹突細胞疫苗，接受輔助免疫治療的患者中位生存時間達到18.3個月，總生存時間31.9個月，而未接受者中位生存時間位7.7個月，總生存時間為17.4 個月［30］。表明應用過繼T 細胞轉移治療明顯有益于BTC 患者預后并能夠顯著延長生存期。

5 結語及展望

BTC作為膽道系統腫瘤，起病隱匿，發病時往往已經到達晚期，現有的干預手段無法滿足對預后的基本要求，迫切需要研究新的有效干預手段以提升患者總生存時間。腫瘤免疫治療是近年來腫瘤治療領域的一個重大突破，能夠通過誘導自身免疫系統攻擊腫瘤細胞達到有效治療的效果。因此，應用免疫檢查點阻斷、腫瘤疫苗和過繼性T 細胞轉移等方法可以促進腫瘤免疫反應，對BTC 進行積極干預，并有效改善患者預后。

雖然目前針對BTC 免疫療法的研究甚少，但仍有證據表明這種方法將成為未來醫生應對BTC 的有力工具。進一步研究證明其具有顯著的臨床功效以及優化治療方案是當務之急，同時也應該聚焦于尋找新的靶點以及聯合療法。對于所有晚期BTC患者應用同一種免疫療法的可行性極低，應根據不同患者選擇特定的靶向治療，比如，對于某一亞群患者使用效力較高的某種方法，抑或是在多肽聯合疫苗使用中做到精準靶向治療。同時，探尋更多的TAA 將有利于為后續個體化治療提供更加詳盡而準確的指導。