大麥旗葉長(zhǎng)和寬的QTL分析

姚琦馥，魏佳泰，李水琴，劉 航，馬 建

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院/貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

大麥(HordeumvulgareL.,2n=14,HH)是世界上僅次于小麥、玉米和水稻的第四大重要谷類作物[1]。較小麥而言，大麥產(chǎn)量低、面筋含量低，且易倒伏[2]，但大麥卻含有種類豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如高蛋白、高膳食纖維、高維生素、低脂肪、低糖等[3-4]，因此大麥在保健方面具有很大的潛在價(jià)值。在種植面積有限的情況下，提高大麥單位面積產(chǎn)量意義重大。

植物葉片的形狀、大小可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如株高、粒長(zhǎng)、粒寬、分蘗、產(chǎn)量等[5-6]，旗葉長(zhǎng)和寬是旗葉大小的關(guān)鍵組成因素[7-9]，是谷類作物提高產(chǎn)量的兩個(gè)重要農(nóng)藝性狀，對(duì)產(chǎn)量具有重要作用[10-11]。旗葉長(zhǎng)和寬均屬于數(shù)量性狀(quantitative trait locus,QTL)，通常受多個(gè)基因控制，受環(huán)境影響也較大[12-14]。與旗葉長(zhǎng)和寬相關(guān)的QTL已經(jīng)在小麥、水稻等谷類作物中被廣泛報(bào)道[15-17]。Farooq等[18]利用水稻材料IR64及其基因?qū)胂祵?duì)旗葉長(zhǎng)和寬進(jìn)行了QTL定位，在2號(hào)和4號(hào)染色體共定位到2個(gè)控制旗葉長(zhǎng)的QTL；在1號(hào)和4號(hào)染色體上共定位到2個(gè)控制旗葉寬的QTL。Bing等[19]利用水稻品種珍汕97和IRAT109構(gòu)建的包含180個(gè)株系的F9代重組自交系群體，在2、3、4、5、6、7和10號(hào)染色體上共檢測(cè)到8個(gè)控制旗葉長(zhǎng)的QTL，在4、5和6號(hào)染色體上共檢測(cè)到5個(gè)控制旗葉寬的QTL。Ma等[11]于11個(gè)不同生態(tài)環(huán)境下在小麥2D和5B染色體上共檢測(cè)到2個(gè)控制旗葉長(zhǎng)的位點(diǎn)QFlw.sicau-2D和QFll.sicau-5B.3，在2D染色體上檢測(cè)到1個(gè)控制旗葉寬的位點(diǎn)QFlw.sicau-2D，可解釋4.09%～35.68%的表型變異。Liu等[6]對(duì)大麥旗葉形態(tài)相關(guān)的QTL進(jìn)行了鑒定，但目前尚未見(jiàn)有人發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，嚴(yán)重影響了通過(guò)調(diào)節(jié)旗葉形態(tài)來(lái)優(yōu)化大麥株型結(jié)構(gòu)，進(jìn)而來(lái)實(shí)現(xiàn)大麥產(chǎn)量提升的目標(biāo)。因此，本研究利用DArT標(biāo)記對(duì)1個(gè)大麥重組自交系(RIL)群體進(jìn)行分析，并基于多環(huán)境對(duì)該群體進(jìn)行旗葉形態(tài)鑒定，以期獲得控制旗葉長(zhǎng)和寬的穩(wěn)定表達(dá)的主效位點(diǎn)，為解析大麥旗葉形態(tài)遺傳機(jī)制和分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為1個(gè)通過(guò)單粒傳方法獲得的F10代大麥RIL群體。該群體包含125個(gè)株系，其親本為經(jīng)過(guò)多年多點(diǎn)鑒定表現(xiàn)穩(wěn)定的J36528和BMJ89材料，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所保存。母本J36528旗葉較父本BMJ89長(zhǎng)，而父本BMJ89旗葉較母本J36528寬。

1.2 試驗(yàn)方法

將RIL群體和親本分別于2016、2017、2018和2019年種植在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州試驗(yàn)基地(分別用2016CZ、2017CZ、2018CZ和2019CZ表示)，于2018和2019年也種植在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安試驗(yàn)田(分別用2018YA和2019YA表示)進(jìn)行表型測(cè)定。試驗(yàn)田按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，包含2個(gè)重復(fù)。每個(gè)株系播種2行，行距0.3 m，行長(zhǎng)1.5 m，株距0.1 m。試驗(yàn)材料均按單粒播種法進(jìn)行播種，田間管理方式按常規(guī)管理方法進(jìn)行。

1.3 旗葉長(zhǎng)和寬表型數(shù)據(jù)的測(cè)定

于小麥開(kāi)花期，每個(gè)株系選取長(zhǎng)勢(shì)良好且均一的單株用直尺進(jìn)行旗葉長(zhǎng)和寬的測(cè)定(不取每一行兩邊的單株，排除邊際效應(yīng))。每個(gè)株系選取6個(gè)單株進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)計(jì)算出每個(gè)株系旗葉長(zhǎng)和寬的平均值，用于后續(xù)分析。

1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位

按照Wenzl等[20]的方法利用DArT標(biāo)記(https://www.diversityarrays.com/)掃描J365283/BMJ89 RIL群體125個(gè)株系中的92個(gè)單株和親本，并利用已有SSR標(biāo)記[21-23]對(duì)92個(gè)株系的群體進(jìn)行分型[24]。對(duì)于存在共分離標(biāo)記的位點(diǎn)，僅保留1個(gè)標(biāo)記進(jìn)行圖譜構(gòu)建。利用JointMap 4.0構(gòu)建連鎖圖譜。利用IciMapping 4.0軟件進(jìn)行QTL檢測(cè)，找到LOD>2.5的位點(diǎn)，同時(shí)計(jì)算出每個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)。將在2個(gè)環(huán)境以上檢測(cè)獲得且表型貢獻(xiàn)率大于10%的QTL視為主效穩(wěn)定表達(dá)的位點(diǎn)。用Triticeae Multi-omics Center網(wǎng)站(http://202.194.139.32/blast/viroblast.php)，將本研究鑒定到的以及前人檢測(cè)到的QTL側(cè)翼標(biāo)記序列與大麥基因型‘Morex’參考基因組[25]進(jìn)行比對(duì)(默認(rèn)參數(shù))，獲得QTL對(duì)應(yīng)的物理位置。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019整理數(shù)據(jù)；使用SAS 9.4軟件計(jì)算旗葉長(zhǎng)和寬的最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)(best linear unbiased prediction，BLUP)值和遺傳力(H2)；使用SPSS 17.0軟件分析旗葉長(zhǎng)和寬在不同環(huán)境及BLUP值的相關(guān)性；使用Origin 9.3軟件繪制旗葉長(zhǎng)和寬的頻率分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體旗葉長(zhǎng)和寬的表型

對(duì)6個(gè)環(huán)境表型數(shù)據(jù)處理后發(fā)現(xiàn)，除了缺失數(shù)據(jù)外，J36528的旗葉長(zhǎng)均極顯著高于BMJ89，J36528的旗葉寬均極顯著低于BMJ89(表1)。RIL群體在不同環(huán)境的旗葉長(zhǎng)和旗葉寬均出現(xiàn)超親分離現(xiàn)象，且旗葉長(zhǎng)和寬均具有較高的遺傳力，分別為0.93和0.82(表1)，表明這2個(gè)性狀主要受遺傳因子影響，受環(huán)境影響較小。旗葉長(zhǎng)和寬在每個(gè)環(huán)境下均呈現(xiàn)近似正態(tài)分布，符合數(shù)量遺傳性狀的特點(diǎn)，適合進(jìn)行QTL定位(圖1)。

圖1 不同環(huán)境下旗葉長(zhǎng)和寬的表型頻率分布Fig.1 Frequency distribution of flag leaf length and width of the RIL population in different environments

表1 不同環(huán)境下親本及RIL群體旗葉長(zhǎng)和寬的表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Phenotypic statistics of flag leaf length and width of the parents and RIL population in different environments

2.2 旗葉長(zhǎng)和寬在不同環(huán)境下的相關(guān)性

從表2可以看出，旗葉長(zhǎng)和寬在不同環(huán)境及BLUP值之間均顯著相關(guān)，旗葉長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)介于0.975～0.997之間，而旗葉寬的相關(guān)系數(shù)介于0.955～0.994之間，進(jìn)一步說(shuō)明旗葉長(zhǎng)寬受環(huán)境影響較小。

表2 旗葉長(zhǎng)和寬在不同環(huán)境下的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients of flag leaf length and width in different environments

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

基于447個(gè)DArT和8個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建大麥群體的遺傳連鎖圖譜，分析結(jié)果(表3)顯示，染色體上標(biāo)記數(shù)量介于26～99之間，平均每條染色體有65個(gè)標(biāo)記；圖譜包含7個(gè)遺傳連鎖群，總長(zhǎng)1 034.96 cM，每條染色體圖譜長(zhǎng)度介于94.96 cM ～218.80 cM，平均每條染色體圖譜長(zhǎng)度為147.85 cM。標(biāo)記密度介于0.96～6.70 cM/標(biāo)記之間，平均標(biāo)記密度為2.27 cM/標(biāo)記。

表3 構(gòu)建的大麥遺傳圖譜中標(biāo)記在染色體上的分布Table 3 Distribution of markers in the constructed barley genetic map

2.4 旗葉長(zhǎng)和寬的QTL檢測(cè)結(jié)果

基于遺傳連鎖圖譜和測(cè)量獲得的4年6個(gè)環(huán)境的表型數(shù)據(jù)，通過(guò)IciMapping 4.0軟件共檢測(cè)到12個(gè)控制旗葉長(zhǎng)和寬的QTL(表4)。其中，檢測(cè)到7個(gè)與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的QTL，分布在2H、5H、6H和7H染色體上。其中，5H染色體上的QFll.sicau-JB-5H.2在3個(gè)環(huán)境及BLUP值中被檢測(cè)到，可解釋12.02%～19.95%的表型變異，LOD值為3.14～3.61，為穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，加性效應(yīng)為正值，表明加性效應(yīng)來(lái)自母本J36528。6H染色體上的QFll.sicau-JB-6H.1在2個(gè)環(huán)境及BLUP值中被檢測(cè)到，可解釋 16.69%～16.99%的表型變異，LOD值為 2.89～4.49，為穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，加性效應(yīng)為負(fù)值，表明其加性效應(yīng)來(lái)自父本BMJ89。QFll.sicau-JB-2H.2和QFll.sicau-JB-7H在2個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到，加性效應(yīng)分別來(lái)自親本J36528和BMJ89可分別解釋9.81%～10.31%和 14.28%～ 14.45%的表型變異。其余3個(gè)QTL只在單一的環(huán)境中被檢測(cè)到，可解釋13.79%～ 28.84%的表型變異。

表4 基于大麥RIL群體檢測(cè)到的與旗葉長(zhǎng)和寬相關(guān)的QTLTable 4 QTLsfor flag leaf length and width detected in the J36528/BMJ89 (JM) population

檢測(cè)到5個(gè)與旗葉寬相關(guān)的QTL，分布在2H、4H、5H、6H和7H染色體上。其中QFlw.sicau-JB-4H在4個(gè)環(huán)境及BLUP值中被檢測(cè)到，可解釋15.03%～24.49%的表型變異，LOD值為2.59～6.91，為穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，加性效應(yīng)為負(fù)值，表明其加性效應(yīng)來(lái)自父本BMJ89。其余4個(gè)QTL均只在單一環(huán)境中被檢測(cè)到，可解釋了14.68%～32.66%的表型變異。

為了進(jìn)一步揭示3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的主效位點(diǎn)(與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的QFll.sicau-JB-5H.2和QFll.sicau-JB-6H.1以及與旗葉寬相關(guān)的QFlw.sicau-JB-4H)的遺傳效應(yīng)，根據(jù)以上3個(gè)位點(diǎn)的側(cè)翼標(biāo)記，將RIL群體中的92個(gè)株系分為2種類型，一種是攜帶相應(yīng)QTL增效位點(diǎn)的株系，另一種是攜帶相應(yīng)QTL減效位點(diǎn)的株系。進(jìn)一步對(duì)2種類型進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖2)表明，對(duì)于3個(gè)QTL而言，含有各自QTL增效位點(diǎn)株系的旗葉長(zhǎng)或旗葉寬在各個(gè)環(huán)境下都顯著或者極顯著高于含有減效位點(diǎn)的株系(除了QFll.sicau-JB-5H.2位點(diǎn)的2019YA環(huán)境)。

*和**分別表示各環(huán)境下親本J36528和BMJ89之間在0.05和0.01水平上差異顯著。白色框代表帶有BMJ89等位基因的純合株系，灰色框代表帶有J36528等位基因的純合株系。＊代表異常值；□代表平均數(shù)。*and**indicate significant differences between J36528 and BMJ89 at the 0.05 and 0.01 levels,respectively.White box represents homozygous lines with BMJ89 allele,and gray box represents homozygous lines with J36528 allele.＊ represents outlier;□ represents mean value.圖2 旗葉長(zhǎng)和寬主效QTL的遺傳效應(yīng)Fig.2 Genetic effect of major QTLs for flag leaf length and width

2.5 與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的2個(gè)主效且穩(wěn)定表達(dá)QTL的聚合效應(yīng)

本研究檢測(cè)到2個(gè)控制大麥旗葉長(zhǎng)的主效且穩(wěn)定表達(dá)的QTL，即QFll.sicau-JB-5H.2和QFll.sicau-JB-6H.1。為了進(jìn)一步分析這2個(gè)QTL的聚合效應(yīng)，本研究根據(jù)QTL的側(cè)翼標(biāo)記對(duì)含有這2個(gè)QTL不同效應(yīng)位點(diǎn)的株系進(jìn)行分析。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，含有2個(gè)QTL增效位點(diǎn)的株系(20個(gè))的旗葉長(zhǎng)顯著或極顯著高于不含任何位點(diǎn)株系(12個(gè))以及僅含有QFll.sicau-5H.2或QFll.sicau-6H.1增效位點(diǎn)的株系，增幅分別為73.28%、14.33%和20.60%。僅含有QFll.sicau-5H.2或QFll.sicau-6H.1增效位點(diǎn)株系的旗葉長(zhǎng)也極顯著高于不含任何位點(diǎn)的株系，增幅分別為51.58%和43.68%。但含有QFll.sicau-5H.2和QFll.sicau-6H.1增效位點(diǎn)的株系之間旗葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

+和-分別代表攜帶和不攜帶目標(biāo)QTL增效位點(diǎn)的株系。圖中百分比數(shù)據(jù)表示兩個(gè)株系之間旗葉長(zhǎng)的變幅。*和**分別表示株系之間在0.05和0.01水平上差異顯著。+ and - represent lines with and without the positive alleles of the target quantitative trait loci (QTL),respectively.The percentage data in the figure represent the variation of flag leaf length between two lines. * and ** indicate significant differences between lines at 0.05 and 0.01 levels,respectively.圖3 兩個(gè)旗葉長(zhǎng)主效QTL的聚合效應(yīng)Fig.3 Multiplying effect of the two major QTLs on flag leaf length of the RIL population

2.6 主效QTL在大麥參考基因組的物理位置

將主效位點(diǎn)QFlw.sicau-JB-4H、QFll.sicau-JB-5H.2和QFll.sicau-JB-6H.1的側(cè)翼標(biāo)記序列錨定到大麥參考基因組上，發(fā)現(xiàn)QFlw.sicau-JB-4H位于大麥4H染色體長(zhǎng)臂584.05～612.36 Mbp區(qū)間，QFll.sicau-JB-5H.2位于5H染色體長(zhǎng)臂379.10～540.62 Mbp區(qū)間，QFll.sicau-JB-6H.1位于6H染色體短臂32.39～ 33.59 Mbp區(qū)間(圖4)。

圖4 大麥旗葉長(zhǎng)和寬3個(gè)主效QTL的遺傳圖譜和物理圖譜Fig.4 Genetic maps and physical maps of the three major QTLs for flag leaf length and width

3 討 論

3.1 加快推進(jìn)挖掘大麥旗葉形態(tài)調(diào)控位點(diǎn)

大麥作為第四大谷類作物，其產(chǎn)量增長(zhǎng)對(duì)人們的生活有著重要意義。旗葉對(duì)于谷物產(chǎn)量的積極作用已有很多報(bào)道，例如Sakamoto等[9]發(fā)現(xiàn)，旗葉較直的水稻新品種可以增加光合作用所需的光捕捉量，進(jìn)而增加籽粒灌漿所需的氮素儲(chǔ)存量，最終提高籽粒產(chǎn)量；Ma等[11]發(fā)現(xiàn)，旗葉大小和形態(tài)是小麥“理想型”的兩個(gè)重要因素，適當(dāng)?shù)钠烊~長(zhǎng)和寬可以增加小麥產(chǎn)量；Simon等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，小麥的旗葉角度和旗葉面積是決定產(chǎn)量的重要性狀。除了與產(chǎn)量相關(guān)的報(bào)道外，在小麥、水稻和玉米中，還有很多關(guān)于旗葉形態(tài)調(diào)控位點(diǎn)鑒定的報(bào)道[13-15,26]。而在大麥中，前人對(duì)于大麥旗葉的研究多集中在光合特性等生理生化指標(biāo)方面[27-29]，而鮮有關(guān)于大麥旗葉相關(guān)性狀位點(diǎn)的報(bào)道，到目前為止，對(duì)于大麥旗葉遺傳調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很有限。大麥作為重要糧食作物和飼料加工作物，提升其產(chǎn)量和品質(zhì)非常必要，本研究獲得的大麥旗葉相關(guān)性狀定位結(jié)果，為進(jìn)一步推進(jìn)大麥旗葉形態(tài)的遺傳研究和精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)，也為產(chǎn)量的提升提供了更多的可能。

3.2 大麥RIL群體旗葉受環(huán)境的影響較小

前人研究發(fā)現(xiàn)，旗葉形態(tài)受環(huán)境影響較大[11,30]，而本研究發(fā)現(xiàn)，大麥旗葉長(zhǎng)和寬在不同環(huán)境下極顯著相關(guān)，即受到環(huán)境的影響較小，原因還有待進(jìn)一步探究。本研究也檢測(cè)到3個(gè)主效且穩(wěn)定表達(dá)的QTL，說(shuō)明這些位點(diǎn)在實(shí)際育種中具有潛在利用價(jià)值。

3.3 與旗葉形態(tài)相關(guān)的穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL

本研究對(duì)RIL群體125個(gè)株系中的92個(gè)單株進(jìn)行了標(biāo)記掃描，構(gòu)建的圖譜準(zhǔn)確可信，基于該圖譜成功鑒定到3個(gè)主效且在多個(gè)環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)的旗葉長(zhǎng)和寬QTL。迄今為止，關(guān)于大麥旗葉長(zhǎng)和寬位點(diǎn)鑒定的報(bào)道極少。Liu等[6]在4H染色體長(zhǎng)臂上鑒定獲得1個(gè)控制大麥旗葉寬的位點(diǎn)qFLW4-18，經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其位于4H染色體601.76 Mbp處，與本文鑒定到的旗葉寬位點(diǎn)QFlw.sicau-JB-4H位于同一個(gè)區(qū)間，因此，推測(cè)兩者可能為等位基因。而Liu等[6]鑒定獲得的大麥旗葉長(zhǎng)QTL主要分布于2H和3H染色體上，在其他染色體未見(jiàn)報(bào)道。因此，推測(cè)QFll.sicau-JB-5H.2和QFll.sicau-JB-6H.1可能為控制大麥旗葉長(zhǎng)的新位點(diǎn)。值得注意的是，在小麥第5部分同源群染色體長(zhǎng)臂已檢測(cè)到主效且穩(wěn)定表達(dá)的旗葉長(zhǎng)位點(diǎn)，如QFll.sicau-5B.3[11]、QFll.sau-SY-5B[10]和QFll.cau-5B[31]。由于小麥和大麥染色體具有一定的線性相關(guān)性，因而，QFll.sicau-JB-5H.2有可能與這些位點(diǎn)具有同源性。此外，小麥春化基因Vrn-B1也位于5B染色體長(zhǎng)臂上[32-33]。這些位于小麥和大麥第5部分同源群長(zhǎng)臂的旗葉相關(guān)QTL與春化基因的相關(guān)性有待進(jìn)一步揭示。

3.4 與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的主效且穩(wěn)定表達(dá)QTL的聚合效應(yīng)

對(duì)控制同一性狀的不同位點(diǎn)進(jìn)行聚合，通常會(huì)起到一定的疊加效應(yīng)[34]。本研究對(duì)控制旗葉長(zhǎng)的主效位點(diǎn)QFll.sicau-JB-5H.2和QFll.sicau-JB-6H.1進(jìn)行聚合分析后發(fā)現(xiàn)，二者疊加后旗葉長(zhǎng)極顯著增加。這為大麥育種中通過(guò)聚合不同位點(diǎn)來(lái)改良旗葉性狀提供了理論依據(jù)。