蛹蟲草胞外多糖的制備、結構分析及其免疫活性

于 悅，陳 卓，王亞非，張明澤，王亞慧，艾 楠，沈明浩,*，姜 斌,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.訥河市人民醫院，黑龍江 訥河 161300）

蛹蟲草俗名蟬花，為子囊菌門、肉座菌目、蟲草菌科的一類食藥兼用的蟲生真菌[1-2]，我國早期炮制著作——《雷公炮炙論》中記載蛹蟲草具有“主小兒天吊、驚癇、瘈疭、夜啼、心悸”等療效。國內外研究證實蛹蟲草中含有多糖、蟲草酸、甘露醇、麥角甾醇及核苷類等生物活性物質，具備抗氧化、提高機體免疫力和降血糖等功效[3-6]，應用領域遍及食品、藥品工業等，不僅用于餐桌上的健康佳肴，還已開發出蛹蟲草多糖酸奶、口服液和調味品[7-9]等一系列產品。由于其營養價值高、價格低廉，作為新一代食品原材料，其活性功能有待深入開發并加以利用。

近年來，蛹蟲草多糖由于產量高、生物活性顯著而成為研究熱點。其中蛹蟲草胞外多糖來源穩定、發酵周期短、不受地域限制并易于規模生產，已在開發增強免疫功能的健康食品中得到了廣泛的應用。目前研究顯示，從蛹蟲草中提取到的胞外多糖分子質量范圍為1.56～36.00 kDa[10-12]，具有清除自由基、誘導癌細胞分化、抗腫瘤、抗肝細胞氧化損傷等生物活性。但目前對蛹蟲草胞外多糖沒有進行更加系統的分離純化，且多糖組分對免疫活性調節的機制研究還鮮見報道，對開發和利用蛹蟲草胞外多糖資源造成了一定的限制。所以本研究在闡明蛹蟲草胞外多糖的提取純化工藝及對多糖結構分析的基礎上，探究其免疫調節機制，對蛹蟲草胞外多糖資源的開發具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級BALB/c雄鼠（體質量（21±2）g），購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證編號：SCXK（遼）2020-0001。

蛹蟲草菌株CICC 14014由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供，甘油于－20 ℃冰箱中保存備用。

DEAE-Sephacel陰離子交換柱、Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱、MTS細胞增殖檢測試劑盒 美國Sigma公司；白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-γ、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM、IgA試劑盒 江萊生物技術有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗小鼠白細胞分化抗原3（CD3+）、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）標記的抗小鼠白細胞分化抗原19（CD19+） 美國eBioscience公司；右旋糖酐分子質量標準套（批號：140637～646-201203） 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備

UVmini-1280紫外分光光度計、IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；CX31光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；LSRFortessa流式細胞儀 美國BD公司；MuLtiskan FC酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草胞外多糖的制備與純化

種子液培養基：取20 g馬鈴薯汁、2 g葡萄糖、1.5 g蛋白胨，溶解于100 mL蒸餾水中；固體培養基另加1.5 g瓊脂；用于發酵的液體培養基另加150 mg KH2PO4和MgSO4及10 mg VB1；以上pH值均為6.8。

使用固體培養基活化蛹蟲草菌株，于24 ℃培養箱中活化7 d，并從中取出1 cm2菌株到液體培養基，在同等溫度150 r/min的搖床中培養3 d獲取種子液，再將100 mL種子液轉接至1 L發酵培養基中，按如上條件繼續培養5 d，取發酵液4 000 r/min離心20 min，收集上清液加3 倍95%乙醇溶液沉淀12 h，先使用活性炭除去色素，再采用Sevae法除蛋白[13]，然后通過截留分子質量為3 500 Da的透析袋分離小分子雜質，最后采用DEAE-Sephacel層析柱（3.6 cm×30 cm）進行分離，上樣質量濃度為20 mg/mL，分別使用蒸餾水和0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min。苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，收集多糖洗脫峰，選擇多糖含量最高的組分，采用Sephadex G-200層析柱（1.5 cm×90 cm）[14]進一步純化，上樣質量濃度為5 mg/mL，洗脫劑為蒸餾水，流速為0.5 mL/min。苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液的多糖質量濃度，收集多糖洗脫峰，濃縮、凍干后蛹蟲草胞外多糖組分，制得蛹蟲草胞外多糖純品。

1.3.2 蛹蟲草胞外多糖的結構分析

1.3.2.1 多糖含量測定

采用硫酸-苯酚法，通過繪制葡萄糖標準曲線對蛹蟲草胞外多糖進行含量測定[15]。

1.3.2.2 多糖分子質量測定

應用高效液相色譜法測定蛹蟲草胞外多糖分子質量[16]。采用示差折光檢測器和Shodex OHpak SB-803 HQ色譜柱（8.0 mm×300 mm，6 μm），設置柱溫40 ℃，進樣量20 μL，流動相為質量分數0.9% NaCl溶液，流速為1.0 mL/min。取右旋糖酐分子質量D0、D1、D2、D3、D4對照品配制溶液（質量濃度5.0 mg/mL）過0.45 μm濾膜后上機，測定其保留時間。根據保留時間與分子質量，由GPC軟件計算回歸方程。同法測定多糖溶液（質量濃度2.0 mg/mL）的出峰時間，根據標準曲線計算蛹蟲草胞外多糖分子質量。

1.3.2.3 紅外光譜分析

將多糖與已恒質量的溴化鉀按質量比1∶100混合研磨、壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內掃描[17]。

1.3.3 蛹蟲草胞外多糖的免疫活性研究

1.3.3.1 免疫損傷小鼠的模型構建及分組

小鼠隨機均分6 組，空白組不建模，其他5 組腹腔注射40 mg/kgbw的環磷酰胺，連續5 d，以構建小鼠免疫損傷模型[18]。5 d后隨機抽取各組小鼠稱質量并制備脾臟切片，以體質量明顯降低，切片中白、紅髓分界模糊，且白髓中脾小體結構分散為造模成功?？瞻缀湍Ｐ徒M灌胃生理鹽水；陽性組灌胃劑量為25 mg/kgbw的匹多莫德；蛹蟲草胞外多糖低、中、高劑量組灌胃劑量各為25、50、100 mg/kgbw蛹蟲草胞外多糖，實驗期21 d。

1.3.3.2 蛹蟲草胞外多糖對免疫損傷小鼠體質量變化及免疫器官指數的測定

實驗期間分別在第1、5、9、13、17、21天稱量小鼠體質量，實驗結束時取小鼠脾臟、胸腺，稱質量，并按公式（1）計算免疫器官指數[18]。

1.3.3.3 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾臟組織形態的影響

無菌取脾，利用質量分數4%多聚甲醛固定包埋后切片（厚度為5 μm）進行蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察組織形態變化，并用CCDNC6051攝影系統拍照[19]。

1.3.4 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

1.3.4.1 MTS法檢測小鼠T、B淋巴細胞增殖率

冰上無菌取脾制備脾細胞懸液[20]。刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）實驗組（誘導T淋巴細胞增殖）加180 μL脾細胞懸液（1.5×106個/mL）和20 μL終質量濃度為5 μg/mL的ConA，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）實驗組（誘導B淋巴細胞增殖）加180 μL脾細胞懸液（1.5×106個/mL）和20 μL終質量濃度為10 μg/mL的LPS，空白對照組加200 μL脾細胞懸液（1.5×106個/mL），每組做3個復孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養36 h，再加10 μL MTS試劑繼續在CO2培養箱中培養3 h，于490 nm波長處測定吸光度，按公式（2）計算細胞增殖率[21]。

1.3.4.2 流式細胞儀法檢測小鼠脾淋巴細胞中T、B淋巴細胞占比

取100 μL脾淋巴細胞懸液（2×106個/mL）置于流式細胞儀測試管中，再依次加入5 μL FITC CD3+（標記T淋巴細胞）和5 μL APC CD19+抗體（標記B淋巴細胞），4 ℃避光放置30 min。用流式細胞儀檢測T、B細胞在脾臟細胞中的占比，采用FlowJo VX軟件進行數據分析[22]。

1.3.5 蛹蟲草胞外多糖對小鼠血清細胞因子水平的影響

眼球采血，2 000 r/min離心15 min后取上清液，檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-6質量濃度，具體按試劑盒操作。

1.3.6 蛹蟲草胞外多糖對小鼠血清免疫球蛋白水平的影響

取各組小鼠血清檢測免疫球蛋白IgG、IgM和IgA含量，具體按試劑盒操作。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草胞外多糖的質量濃度

葡萄糖標準曲線如圖1所示，標準曲線方程為y=0.01x－0.010 2，R2=0.999 2，線性關系良好。由回歸方程計算出蛹蟲草胞外多糖質量濃度為3.15 mg/mL。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig. 1 Standard curve for glucose determination

2.2 蛹蟲草胞外多糖的純化結果

采用DEAE-Sephacel層析柱聯合Sephadex G-200層析柱對蛹蟲草胞外多糖進行純化，如圖2所示，在第24～30管得到了一個完整對稱的吸收峰，經計算（帶入2.1節中標準曲線方程），得到多糖的純度為86.13%。

圖2 蛹蟲草胞外多糖純化洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of Cordyceps militaris exopolysaccharide

2.3 蛹蟲草胞外多糖的分子質量

由圖3可見，蛹蟲草胞外多糖溶液相色譜圖呈現一個銳利對稱峰，將保留時間（X）16.686 min帶入回歸方程lgmw=－0.17X3+0.85X2－14.75X+90.48（R2=0.999 4）計算得出蛹蟲草胞外多糖的分子質量為3.67 kDa。

圖3 蛹蟲草胞外多糖的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of the exopolysaccharide from Cordyceps militaris

2.4 蛹蟲草胞外多糖的紅外光譜分析

如圖4所示，3 363.86 cm－1處為氫鍵締合的O—H伸縮振動峰[23]；2 924.09 cm－1和2 895.15 cm－1處為次甲基的C—H伸縮振動峰[24]；以上是糖類特征吸收峰，由此推斷蛹蟲草胞外多糖符合糖類的一般結構特征。1 404 cm－1處為C—H的彎曲振動峰[25]；1 080.14 cm－1處出現吸收峰表明有吡喃糖環的存在，說明結構中可能存在α-(1→6)糖苷鍵[26]；844.82 cm－1處是β-糖苷鍵的特征峰[27]。綜上所述，蛹蟲草胞外多糖中既有α-糖苷鍵構型，同時又有β-糖苷鍵構型的吡喃糖存在。

圖4 蛹蟲草胞外多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 FTIR spectrum of the exopolysaccharide from Cordyceps militaris

2.5 蛹蟲草胞外多糖對免疫抑制小鼠體質量及免疫器官指數的影響

如圖5A所示，在實驗第5天，發現造模小鼠體質量急劇降低，與未注射環磷酰胺的小鼠體質量差異極顯著（P＜0.01），表明造模成功。治療期間蛹蟲草胞外多糖劑量組小鼠體質量逐漸增加，最終恢復至與空白組水平基本相近，表明蛹蟲草胞外多糖可緩解因環磷酰胺導致的小鼠體質量減輕，具有一定的免疫調節能力。

免疫器官指數如圖5B所示，與空白組相比，模型組小鼠的胸腺和脾臟指數極顯著降低（P＜0.01），可見環磷酰胺對小鼠的胸腺和脾臟具有嚴重的損傷作用。經給藥后，陽性組小鼠基本恢復到與空白組無顯著差異，蛹蟲草胞外多糖組隨劑量增加免疫器官指數呈逐漸增加的趨勢，高劑量蛹蟲草胞外多糖組小鼠免疫器官指數與空白組無顯著差異，由此說明蛹蟲草胞外多糖具有改善脾臟和胸腺損傷的作用。

圖5 蛹蟲草胞外多糖對小鼠體質量和免疫器官指數的影響Fig. 5 Effect of the extracellular polysaccharide from Cordyceps sinensis on body mass and immune organ indexes in immunosuppressed mice

2.6 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾臟組織形態學的影響

如圖6所示，模型組小鼠脾臟紅髓與白髓之間邊界不分明，淋巴鞘結構疏松（圖6B），與葉蕾[28]闡述的現象一致，證明造模成功?？瞻捉M（圖6A）及陽性組（圖6C）小鼠紅、白髓分界明顯，白髓中存在較多結構完整的脾小體，紅髓中脾索整體相連，脾竇明顯。低劑量蛹蟲草胞外多糖組紅髓與白髓之間邊界不分明（圖6D）。中劑量蛹蟲草胞外多糖組（圖6E）和高劑量蛹蟲草胞外多糖組（圖6F）白髓部分變得更清晰、邊緣區增厚、脾小體結構完整，組織形態逐漸恢復至與空白組和陽性組接近，這表明蛹蟲草胞外多糖可有效緩解由環磷酰胺導致的脾組織結構異常。

圖6 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾臟組織形態學的影響Fig. 6 Effect of the exopolysaccharide from Cordyceps militaris on morphology of spleen tissues in immunosuppressed mice

2.7 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾淋巴細胞的影響

2.7.1 小鼠脾淋巴細胞增殖率

小鼠T、B淋巴細胞增殖率見圖7，與空白組相比，模型組小鼠T、B淋巴細胞增殖率均極顯著降低（P＜0.01），證明環磷酰胺對鼠T、B淋巴細胞有嚴重的損害作用。經給藥后，蛹蟲草胞外多糖劑量組的B淋巴細胞增殖率升高，并隨給藥劑量增加，呈現劑量效應關系，高劑量組效果最佳；而蛹蟲草胞外多糖劑量組的T淋巴細胞增殖率隨著給藥劑量的增加呈逐漸下降趨勢，但低劑量組與模型組相比對T淋巴細胞的增殖有一定的促進作用。由此推測蛹蟲草胞外多糖對B淋巴細胞的增殖有促進效果，對T淋巴細胞增殖存在低劑量促進高劑量抑制的現象。

圖7 蛹蟲草胞外多糖對小鼠T、B細胞增殖率的測定Fig. 7 Proliferation rates of T and B cells in mice administered with the extracellular polysaccharide from Cordyceps militaris

2.7.2 小鼠脾淋巴細胞中T、B細胞占比

由圖8可知，模型組小鼠脾臟T、B淋巴細胞占比極顯著低于空白組（P＜0.01），說明環磷酰胺對小鼠T、B細胞損傷作用嚴重。與模型組相比，低、中、高劑量蛹蟲草胞外多糖組小鼠T淋巴細胞占比分別增加了（11.08±0.21）%、（23.84±0.32）%和（4.97±0.17）%，B淋巴細胞占比分別增加了（18.45±0.23）%、（31.21±0.28）%和（40.51±0.32）%，可見，隨蛹蟲草胞外多糖劑量增加，B淋巴細胞占比升高，而T淋巴細胞占比先增加后降低，說明蛹蟲草多糖可有效促進B淋巴細胞增殖。

圖8 蛹蟲草胞外多糖對小鼠脾淋巴細胞中T、B細胞占比的影響Fig. 8 Effect of the extracellular polysaccharide from Cordyceps militaris on the proportions of T and B cells in spleen lymphocytes of mice

2.8 蛹蟲草胞外多糖對小鼠血清中細胞因子水平的影響

如圖9所示，模型組小鼠細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α質量濃度均極顯著低于空白組（P＜0.01），證明造模成功。隨給藥劑量增加，蛹蟲草胞外多糖劑量組IL-6和TNF-α的質量濃度逐漸遞增至正常水平，而IL-2和IFN-γ的質量濃度隨給藥劑量增加呈下降趨勢。可見蛹蟲草胞外多糖可有效調節環磷酰胺所致的細胞因子分泌異常。

圖9 蛹蟲草胞外多糖對小鼠血清細胞因子質量濃度的影響Fig. 9 Effect of the extracellular polysaccharide from Cordyceps militaris on cytokine levels in serum of mice

2.9 蛹蟲草胞外多糖對免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白水平的影響

如圖10所示，模型組小鼠血清IgG、IgA及IgM質量濃度極顯著低于空白組（P＜0.01），可知環磷酰胺對小鼠血清細胞因子存在較大影響，蛹蟲草胞外多糖劑量組的IgG、IgA及IgM質量濃度隨給藥劑量的增加而遞增，表明蛹蟲草胞外多糖可改善由環磷酰胺導致的小鼠免疫球蛋白質量濃度降低。

圖10 蛹蟲草胞外多糖對小鼠的血清免疫球蛋白質量濃度的影響Fig. 10 Effect of the extracellular polysaccharide from Cordyceps militaris on serum immunoglobulin levels in mice

3 討 論

環磷酰胺作為一種典型的化療藥物和免疫抑制劑，對治療癌癥具有良好的療效，但在化療過程中可產生惡心、消化道不適、免疫低下和骨髓抑制等諸多不良反應[29]。故采用天然食品制備功能性食品或營養佐劑替代化學或生物合成藥物來預防和緩解環磷酰胺所帶來的免疫損傷已成為研究熱點。目前研究顯示，蛹蟲草胞外多糖具有較強的免疫調節活性，王永敏等[11]分離得到分子質量為3.49×104kDa的蛹蟲草胞外多糖，且其具備調節機體免疫的活性。本研究從蛹蟲草菌株發酵液中分離得到3.67 kDa的低分子質量多糖，研究表明，隨給藥劑量的增加，蛹蟲草胞外多糖促進了B淋巴細胞的增殖，對T淋巴細胞的增殖先促進后抑制。此結果表明蛹蟲草胞外多糖改善小鼠免疫功能的作用機制主要是參與小鼠的體液免疫，進而增加小鼠體質量，預防脾臟和胸腺萎縮，此結果與徐廷萬等[30]的研究結果一致。

本實驗考察了蛹蟲草胞外多糖對免疫球蛋白分泌水平的影響，結果表明，蛹蟲草胞外多糖可有效提高血清免疫球蛋白的質量濃度，并通過逆轉免疫紊亂來維持體內平衡，從而增強體液免疫。其中，對IgG和IgM作用顯著，前者在免疫球蛋白中相對含量最高，后者作用于抗感染的初始階段[31]。因此，血清中免疫球蛋白的質量濃度可體現機體的體液免疫功能。其次，本實驗也考察了TNF-α和IL-6的水平，其變化趨勢與免疫球蛋白相似，表明蛹蟲草胞外多糖可以恢復環磷酰胺導致的TNF-α和IL-6水平下降，進而改善機體免疫功能。對細胞因子IFN-γ和IL-2的水平影響結果顯示，蛹蟲草胞外多糖低劑量組對其分泌發揮促進作用，中、高劑量組存在一定的抑制作用，水平略有下降，但仍高于模型組水平，可能是因為IFN-γ和IL-2主要由Th1細胞分泌用于介導細胞免疫。以上研究證明蛹蟲草胞外多糖能有效緩解由環磷酰胺導致的免疫功能低下，且主要通過調節體液免疫來增強機體的免疫功能。可在使用環磷酰胺治療癌癥的過程中，作為免疫增強佐劑以達到增強機體免疫功能的目的，進而加快患者術后恢復。且由于其具有營養保健功效，還可作為人們日常生活中提高免疫力的保健食品進行推廣。詳細的作用機制仍需進一步研究論證。

4 結 論

本實驗從蛹蟲草發酵液中提取得到的蛹蟲草胞外多糖質量濃度為3.15 mg/mL，經分離純化后得到單一多糖分子質量為3.67 kDa，純度可達86.13%。該多糖可修復環磷酰胺導致的BALB/c小鼠免疫功能損傷，明顯提高免疫器官指數，能夠有效促使T細胞（低劑量時）、B細胞增殖和IgG、IgA、IgM、TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ的分泌，免疫調節效果顯著。此研究為開發蛹蟲草發酵液資源建立了部分理論支撐。