依托咪酯對DNBS 誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎氧化應(yīng)激和炎癥因子表達的干預(yù)及機制研究①

李 曦 吳 仲 代麗娜 李仕梅 王子明 許凌懿 孔 航

（貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，貴陽 550001）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性大腸黏膜炎癥，尤其影響結(jié)腸和直腸，其特點為間歇性的復(fù)發(fā)，之后緩解，隨后導(dǎo)致黏膜損傷［1-3］。UC 主要累及結(jié)腸和直腸的遠端黏膜，導(dǎo)致結(jié)腸疼痛、潰瘍、水腫、血性腹瀉、液體和電解質(zhì)減少以及體重減輕等癥狀［4-6］。持續(xù)性UC 增加結(jié)腸癌的風險，它是炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）的主要類型之一，是環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果，導(dǎo)致免疫反應(yīng)和腸道炎癥［7-8］。UC 的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，一項研究報告顯示每10萬人中有1.0至15.0例UC 患者［9］。UC的傳統(tǒng)治療方法包括5-氨基水楊酸、硫嘌呤和皮質(zhì)類固醇［10-12］。免疫調(diào)節(jié)劑包括鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，如環(huán)孢菌素和他克莫司也被證明對UC 有益［3］。然而這些藥物伴隨著嚴重的副作用，治療效果也不理想。因此，有必要尋找新的治療藥物來有效地控制UC 的癥狀和并發(fā)癥。依托咪酯（Etomidate，Eto），是一種短效的非巴比妥酸鹽類催眠藥，與其他藥物（如丙泊酚或咪達唑侖）相比，具有穩(wěn)定心血管和減少呼吸抑制的優(yōu)勢［13-14］。因此多年來一直是低血壓患者的首選誘導(dǎo)劑［15］。但使用Eto 也有一定的副作用，比如肌陣攣和腎上腺皮質(zhì)功能抑制等不良反應(yīng)［16］。研究表明丙泊酚和Eto 聯(lián)合應(yīng)用可有效降低機體應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，提高胃腸鏡檢過程中的安全性［17］。本文主要探究了Eto 對DNBS 誘導(dǎo)的UC大鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Eto、2，4-二硝基苯磺酸（2，4-dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）購自美國Sigma公司；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司；抗Bax，Bcl-2 抗體購自英國Abcam 公司；抗NF-κB p65（p-P65）抗體及辣根酶（HRP）標記二抗購自上海賽信通生物試劑有限公司；Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）；TUNEL 試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.1.2 實驗動物 40只健康SPF級Wistar大鼠，8～10周齡，平均體質(zhì)量（200±20）g，購自中國食品藥品檢定研究所實驗動物資源研究所，合格證號SCXK（京）2014-0013。將動物圈養(yǎng)在溫度可控的房間中，光照時間為12 h，溫度為22℃～24℃，濕度為50%～60%，標準的實驗室食物和任意的自來水喂養(yǎng)，實驗前飼養(yǎng)1周使動物適應(yīng)環(huán)境條件。

1.2 方法

1.2.1 DNBS 結(jié)腸炎的誘導(dǎo)［18］禁食12 h 后，用10%氯胺酮（50 mg/kg）和2%二甲苯嗪（5 mg/kg）麻醉動物，將30 mg 的DNBS 溶解在250 μl 乙醇（50% v/v）中，在距每只動物肛門8 cm 處用聚四氟乙烯導(dǎo)管進行結(jié)腸內(nèi)給藥，并且倒置15 min，以防止DNBS 溶液逸出。對照組在同一環(huán)境下用0.9%生理鹽水。造模完成后，每天對動物稱重，并評估肛門或糞便中是否存在腹瀉和血液，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）［19］。模型組DAI 若為對照組的2倍以上，視為造模成功。

1.2.2 給藥和樣品采集 40 只Wistar 大鼠隨機分為5組（n=8），對照組、模型組（DNBS）和模型加藥組（DNBS+Eto）3 個劑量組：1.5 mg/kg（低劑量）、3 mg/kg（中劑量）、6 mg/kg（高劑量）。除對照組外，其他4組按1.2.1方法造模后自由飲食飼養(yǎng)，第3 天根據(jù)DAI判斷所有大鼠造模成功。造模成功后按藥物劑量每天腹腔注射給藥1 次，連續(xù)2 周。實驗結(jié)束后，10%氯胺酮麻醉，腹主動脈取血，分離血清，-20℃保存；結(jié)腸組織樣本一部分保存于-80℃，一部分保存于37%～40%甲醛水溶液中。

1.2.3 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosal damage index，CMDI）的觀測 將大鼠處死后，取出結(jié)腸段，清除脂肪和腸系膜，在縱向打開后，評估結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)，評分范圍為：0，正常結(jié)腸（無損傷）；1，輕度充血，無潰瘍；2，有閃點的潰瘍或小的炎癥區(qū)，充血水腫；3，大的炎癥區(qū)和＜1 cm 的潰瘍；4，大面積組織損傷和＞1 cm的延伸。

1.2.4 結(jié)腸組織學觀察及評分（histopathological score，HS）取大鼠結(jié)腸病變最明顯的一段，將其浸入10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織學變化并評分。HS評分標準為：0，大鼠結(jié)腸黏膜無水腫、潰瘍；1，腸黏膜輕度水腫和炎癥潰瘍，病變在黏膜層；2，腸黏膜中度水腫和炎癥潰瘍，病變到達肌層；3，腸黏膜重度水腫和炎癥潰瘍，病變遷延至漿膜層。

1.2.5 TUNEL 凋亡染色 將石蠟包埋的切片在二甲苯中脫蠟，在分級乙醇系列中脫水，用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液將石蠟包埋，然后在TUNEL 反應(yīng)混合物中37℃避光孵育1 h。用PBS 沖洗3 次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blot 取1.2.2 保存的大鼠結(jié)腸組織，提取總蛋白，用Nanodrop 2000 測量蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后，將膜用含有5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液封閉2 h。然后，將膜與抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、ACTIN（1∶1 000）、p-P65 和P65（1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，并與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。使用增強的化學發(fā)光劑ECL及Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.7 氧化應(yīng)激指標檢測 取1.2.2 收集的大鼠血清，利用SOD和MDA試劑盒按照說明書對大鼠血清SOD、MDA水平進行檢測。

1.2.8 ELISA 實驗 取1.2.2 收集的大鼠血清，按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達。

2 結(jié)果

2.1 Eto 可改善DNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠的體質(zhì)量如圖1 所示，模型組（DNBS 組）DAI 指數(shù)均值為2.05，遠高于對照組DAI 指數(shù)0.07 的2 倍（P＜0.05），模型構(gòu)建成功。與模型組（DNBS 組）相比，DNBS+Eto中、高劑量組隨藥物劑量增加DAI指數(shù)顯著下降（P＜0.05），低劑量組DAI指數(shù)無明顯變化。

圖1 大鼠DAI評分Fig.1 Rat DAI score

2.2 Eto 可減輕UC 大鼠結(jié)腸組織的病變程度 如圖2所示，對照組大鼠結(jié)腸未觀察到組織學改變，模型組結(jié)腸黏膜下層出現(xiàn)跨壁壞死、腸隱窩萎縮、水腫糜爛和明顯的白細胞浸潤，CMDI 指數(shù)和HS 評分明顯高于正常組（P＜0.05），與模型組相比，DNBS+Eto 中、高劑量給藥組病變程度明顯減輕，高劑量組結(jié)腸組織形態(tài)基本恢復(fù)正常，CMDI 和HS 評分呈劑量依賴性顯著降低（P＜0.05），低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 肉眼和鏡下觀察結(jié)腸組織病理狀態(tài)Fig.2 Pathological state of colon tissue was observed by naked eye and microscope

2.3 Eto可抑制UC大鼠結(jié)腸組織細胞凋亡 如圖3所示，與對照組相比，模型組細胞凋亡率和Bax/Bcl-2 顯著上調(diào)（P＜0.05），與模型組相比，DNBS+Eto中、高劑量組隨劑量增加，細胞凋亡率和Bax/Bcl-2顯著下調(diào)（P＜0.05），低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 結(jié)腸組織細胞凋亡檢測Fig.3 Detection of apoptosis in colon tissue

2.4 Eto 可減輕UC 大鼠結(jié)腸組織的氧化應(yīng)激損傷 如圖4所示，與對照組相比，模型組SOD水平明顯降低（P＜0.05），MDA 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，Eto 中、高劑量組SOD 水平隨藥物劑量增加而升高，MDA水平隨藥物劑量增加而降低（P＜0.05），Eto低劑量組SOD及MDA水平無明顯變化。

圖4 氧化指標檢測Fig.4 Detection of oxidation indexes

2.5 Eto 可減弱UC 大鼠結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng) 如圖5 所示，模型組中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平及p-P65表達均顯著高于對照組（P＜0.05）。與模型組相比，Eto 中、高劑量組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平及p-P65表達呈劑量依賴性顯著下調(diào)（P＜0.05），Eto低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 ELISA檢測炎癥因子水平及Western blot檢測NF-κB磷酸化Fig.5 Levels of inflammatory factors detected by ELISA and phosphorylation of NF-κB detected by Western blot

3 討論

如今，UC 的治療方法不斷發(fā)展，但可用療法僅限于減輕癥狀和非特異性免疫調(diào)節(jié)劑［20］。因此，UC的治療仍然是具有重大醫(yī)療需求的領(lǐng)域。ZHANG等［21］研究發(fā)現(xiàn)Eto 可通過降低膿毒癥大鼠糖皮質(zhì)激素的表達來抑制NF-κB 激活，表明Eto 具有抗炎功效。本研究利用DNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠體質(zhì)量顯著下降，DAI 指數(shù)、CMDI 指數(shù)、HS 評分明顯升高，黏膜下層出現(xiàn)跨壁壞死、水腫糜爛和明顯的炎癥細胞浸潤，與文獻報道一致，提示造模成功［22］。給予Eto 3 mg/kg、6 mg/kg處理后，隨藥物劑量增加，UC 大鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)顯著改善，DAI 指數(shù)、CMDI 指數(shù)、HS 評分明顯下降，且病變程度明顯減輕。因此，Eto 對DNBS誘導(dǎo)的大鼠UC具有明顯的治療作用。

Bcl-2 蛋白家族在細胞凋亡過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中Bcl-2 功能是抑制細胞凋亡，Bax 功能是促進細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2決定了細胞凋亡與否［23］。本研究中DNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠細胞凋亡率和Bax/Bcl-2 均顯著上調(diào)，與模型組相比，Eto 中、高劑量組細胞凋亡率和Bax/Bcl-2 均顯著下調(diào)。因此，Eto可抑制大鼠UC誘導(dǎo)的細胞凋亡。

氧化應(yīng)激是由自由基或過氧化物增加所引起的一種機體反應(yīng)。自由基產(chǎn)生的增加對膜磷脂產(chǎn)生細胞毒性作用，導(dǎo)致形成有毒產(chǎn)物，如MDA 廣泛用于評估氧化應(yīng)激［10］。而SOD 具有減少脂質(zhì)過氧化和清除自由基的作用［24］。本研究中Eto 中、高劑量組中SOD含量較模型組顯著增加，MDA 含量顯著降低，提示Eto 通過抑制氧化應(yīng)激保護UC 大鼠結(jié)腸組織。

UC的一個主要特征是高水平的促炎癥介質(zhì)，如細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6），進而導(dǎo)致慢性炎癥、潰瘍和結(jié)腸黏膜損傷、白細胞浸潤［25］。TNF-α有助于上皮屏障的破壞，誘導(dǎo)上皮細胞的凋亡，IL-6參與中性粒細胞的募集和激活，加劇炎癥性腸炎的炎癥狀態(tài)，IL-1β和IL-6過量產(chǎn)生可能導(dǎo)致腸道炎癥加重和腸道運動障礙［20］。本研究中Eto 中、高劑量組可顯著降低DNBS誘導(dǎo)的UC大鼠血清中IL-1β，IL-6和TNF-α 細胞因子的高表達，因此Eto 可通過抗炎保護UC 大鼠的結(jié)腸組織。NF-κB 作為一條經(jīng)典的炎癥信號通路，對誘發(fā)炎癥有重要作用［26］。本研究發(fā)現(xiàn)UC 大鼠中p-P65 表達水平相較于對照組顯著上調(diào)，與模型組相比，Eto 中、高劑量組中p-P65 表達水平顯著下調(diào)。因此UC 大鼠確實通過NF-κB 誘導(dǎo)促炎細胞因子的產(chǎn)生來增強炎癥反應(yīng)，而Eto 通過下調(diào)NF-κB 來抑制炎癥的早期階段和多個促炎基因的上調(diào)，從而減輕DNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

Eto 可通過增加GABA 能受體活性來抑制神經(jīng)元興奮性，防止炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生［27］。GABA受體已被證實在免疫細胞上存在，可降低外周巨噬細胞炎癥因子的產(chǎn)生［28］。研究表明GABA 能夠抑制過度自噬，有效增強腸道黏膜屏障功能，對實驗性結(jié)腸炎具有治療作用［29］。因此Eto 對DNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠保護機制可能是通過激活GABA 能受體活性介導(dǎo)的，下一步可通過非Eto類GABA能激動劑進一步證實。總之，本研究表明Eto對DNBS誘導(dǎo)的大鼠UC 有一定的保護作用，其機制可通過減少細胞凋亡，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制NF-κB 通路的激活來減少TNF-α 等炎癥因子釋放，從而減輕UC 炎癥損傷，保護并促進結(jié)腸組織功能恢復(fù)。因此，本研究為臨床上使用Eto 治療UC 提供了更充分的實驗依據(jù)。