miR-196b調控PI3K/Akt通路對宮頸癌細胞順鉑耐藥的影響研究

張玉清 邢惠海 劉立秋 王 敬 徐書方

（石家莊醫學高等專科學校，石家莊 050599）

宮頸癌是全球范圍內危害較嚴重的惡性腫瘤之一，發病率位于女性惡性腫瘤中第2位，85%以上患者來自中低收入的發展中國家［1-2］。中國每年宮頸癌的發病率占全球1/4 以上，45 歲以上人群的宮頸癌新發病例約7萬，占總數的70%，且近年其發病呈逐漸年輕化趨勢，給全球女性健康造成嚴重傷害［3-4］。微小RNA（miRNA）是一種內源性非編碼單鏈小分子的RNA，其長度約為18～25個核苷酸，可與mRNA 3'端非編碼區（3'UTR）結合，調節基因表達，參與個體發育、細胞增殖、凋亡和分化等生命活動過程［5-6］。研究顯示，miR-196b作為其中一種miRNA在宮頸癌組織中表達上調，可能參與調控宮頸癌疾病的發生發展過程［7］，但是有關miR-196b 對宮頸癌細胞順鉑耐藥影響的研究目前尚未見相關報道。本研究通過下調HeLa/DDP 細胞中miR-196b 基因的表達，觀察下調miR-196b表達對宮頸癌細胞順鉑耐藥的影響，初步探討miR-196b在宮頸癌細胞順鉑耐藥中的作用機制，為后期相關研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細胞株HeLa、順鉑耐藥細胞株HeLa/DDP（貨號分別為XB-0620、XB-0643）購自上海奧陸生物科技有限公司；miR-196b inhibitor、negative control（NC）（貨號分別為：hsa-mir-196b、miR03101）購自百奧邁克生物技術有限公司；化療藥順鉑（貨號：15663-27-1，純度：Pt≥98%）購自寶雞市國康生物科技有限公司；LipofectaminTM2000（貨號為：rs374987523）購自美國Invitrogen 公司；鼠抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylase B kinase，p-Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體（批號分別為：RAB1911、RAB1916、RAB1908、RAB1923、RAB1928）購自美國Sigma 公司；PVDF 膜、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗（貨號分別為：F619537、D110098）購自上海生工生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒（貨號分別為：C510003、C503021）購自美國Thermo 公司；RNA 提取試劑盒（貨號：DP419）購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix（貨號：Q111-02）購自南京vazyme 生物公司；蛋白凝膠成像儀（型號：Gel Doc XR+）購自Bio-Red 公司；qRT-PCR 儀購自美國Bio-Rad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成等。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及轉染 收集對數生長期HeLa/DDP、HeLa 細胞，在培養基中分別加入終濃度為0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L 順鉑藥物，培養48 h，MTT 法檢測HeLa/DDP、HeLa 細胞的IC50，每組設6 個復孔，篩選最佳順鉑濃度。培養對數生長期HeLa/DDP細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6 孔細胞板（1×106個/孔），待細胞融合度達80%時，更換為無血清DMEM 培養基，采用LipofectamineTM2000法進行轉染，轉染后用無血清DMEM培養基繼續培養24 h，將終濃度為5 μmol/L 順鉑加入HeLa/DDP細胞中，繼續培養48 h。將HeLa/DDP細胞根據轉染試劑的不同分為3組，空白對照（僅用轉染試劑處理）+DDP，陰性對照（轉染NC）+DDP組，miR-196b inhibitor（轉 染miR-196b inhibitor）+DDP組，轉染操作步驟嚴格按照LipofectaminTM2000試劑盒說明書進行，轉染后培養箱繼續培養。

1.2.2 MTT法檢測細胞IC50收集1.2.1中的各組細胞，用MTT 檢測法檢測各組細胞的IC50，將細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，按2×104個/孔的細胞密度鋪于96孔板，每組細胞培養液中分別加入順鉑至終濃度0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L，每組設6 個復孔，培養48 h 后每孔加20 μl MTT（5 mg/ml），37℃避光孵育4 h，棄上清，加DMSO（150 μl/孔）充分振蕩使結晶溶解。酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度值，6 個復孔取平均值。實驗重復6 次，應用統計軟件繪制細胞存活率曲線并求出IC50。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集1.2.1轉染后的各組細胞，用胰蛋白酶消化，預冷PBS洗滌2 次，離心棄上清，配制成1×106個/ml 的細胞懸液，100 μl 細胞懸液加入5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復6次。

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測各組細胞miR-196b表達水平RNA 提取試劑盒提取1.2.1 中各組細胞的總RNA，經反轉錄得cDNA。采用定量PCR儀對miR-196b基因進行PCR 擴增。qRT-PCR 反應體系共10 μl：miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA（50 ng/μl）1 μl，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40 個循環。miR-196b 及其內參U6 引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法對miR-196b表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.5 Western blot檢測各組細胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達 按照蛋白提取試劑盒說明書提取1.2.1 各組細胞中總蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒對細胞中總蛋白含量進行測定。采用SDSPAGE 分離等量蛋白質，將蛋白質轉PVDF 膜上，置于4℃下添加Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 一抗及βactin 一抗（1∶500），孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）常溫孵育2 h。采用Tanon 600 圖像分析系統對蛋白水平Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR進行定量分析。

1.3 統計學分析 本研究所得數據均采用SPSS22.0 軟件進行統計，計數資料以n（%）表示；計量資料用表示，行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-196b 在HeLa/DDP、HeLa 細胞中表達水平比較 與HeLa 細胞miR-196b 表達水平（0.96±0.21）相比，HeLa/DDP 細胞中miR-196b 表達水平（1.58±0.25）顯著升高（t=4.651，P＜0.05）。

2.2 檢測HeLa/DDP、HeLa 對順鉑的敏感性 隨順鉑濃度增加（0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L）HeLa/DDP、HeLa 細胞活力下降，經計算HeLa 的IC50為4.86 μmol/L，HeLa/DDP 的IC50為68.13 μmol/L，與HeLa 對順鉑的IC50［（4.86±1.12）μmol/L］相比，HeLa/DDP 對順鉑的IC50［（68.13±7.01）μmol/L］顯著升高（t=21.831，P＜0.05）。

2.3 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞中miR-196b表達的影響 與空白對照+DDP 組、陰性對照+DDP組相比，轉染后24 h、48 h，miR-196b inhibitor-1+DDP 組、miR-196b inhibitor-2+DDP 組、miR-196b inhibitor-3+DDP 組、miR-196b inhibitor-4+DDP 組細胞中miR-196b 表達水平均明顯減少（P＜0.05），其中以轉染48 h 后，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細胞中miR-196b表達水平最低（P＜0.05），因此選miR-196b inhibitor-2+DDP組轉染后48 h進行后續研究。見表2。

表2 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞中miR-196b 表達的影響（，n=6）Tab.2 Effect of down regulating miR-196b on expression of miR-196b in HeLa/DDP cells（，n=6）

表2 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞中miR-196b 表達的影響（，n=6）Tab.2 Effect of down regulating miR-196b on expression of miR-196b in HeLa/DDP cells（，n=6）

2.4 下 調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞IC50的影響與空白對照+DDP 組、陰性對照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細胞IC50顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 下調miR-196b 對HeLa/DDP 耐藥細胞IC50 的影響（）Tab.3 Effect of down regulating miR-196b on IC50 of HeLa/DDP resistant cells（）

2.5 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞凋亡的影響 與空白對照+DDP 組、陰性對照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。見圖1、表4。

圖1 下調miR-196b對HeLa/DDP細胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells

表4 下調miR-196b對HeLa/DDP細胞凋亡率的影響（）Tab.4 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells（）

表4 下調miR-196b對HeLa/DDP細胞凋亡率的影響（）Tab.4 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells（）

2.6 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達的影響 與空白對照+DDP組、陰性對照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細胞p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），Akt 蛋白水平差異無統計學意義。見表5、圖2。

表5 下調miR-196b對HeLa/DDP細胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達的影響（）Tab.5 Effect of down regulating miR-196b on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells（）

表5 下調miR-196b對HeLa/DDP細胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達的影響（）Tab.5 Effect of down regulating miR-196b on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells（）

圖2 下調miR-196b 對HeLa/DDP 細胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達的影響Fig.2 Effect of miR-196b down regulation on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統發病率最高的惡性腫瘤［8］。近年來隨著我國人口老齡化進程的加劇以及生活環境、飲食習慣的轉變，宮頸癌發病率呈逐漸上升趨勢，已成為影響中老年女性人群身心健康和生活質量的主要腫瘤疾病［9］。目前宮頸癌治療方案主要為手術輔助鉑類藥物化療及同步放化療，其中鉑類抗癌藥物作為術前或術后的輔助治療，一定程度上對患者預后具有改善作用，在宮頸癌的治療中占有重要位置［10］。但部分患者在化療時，會產生順鉑耐藥從而影響療效導致高病死率［11］，因此積極研究探索宮頸癌順鉑耐藥的機制，提高宮頸癌細胞對順鉑化療藥物的敏感性，成為目前醫學研究重點。本研究探討下調HeLa/DDP 細胞中miR-196b 表達對宮頸癌細胞順鉑耐藥的影響，并分析其作用機制。

miRNA 是一類起始于細胞核，成熟于細胞質的非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于真核細胞中，在哺乳動物中成熟miRNA 可對體內60%左右基因進行調節［12-13］。研究表明，人類基因中有2%～3%的miRNA 參與體內30%左右的基因調控，miRNA 在人體所有組織及血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均可表達［14］。研究發現，miRNA 具有癌基因與抑癌基因的雙重作用，其可能參與腫瘤的發生、發展過程［15］。研究者通過對宮頸癌組織標本進行miRNA表達譜分析，發現70 個miRNA 表達明顯異常，其中68 個miRNA 表達顯著上調，而miR-149、miR-203 表達明顯下調，表明miRNA 在宮頸癌發生、發展中具有一定作用［16-17］。余昆等［18］研究發現通過下調miR-196b-5p 表達促進直腸癌細胞的增殖。ZHU 等［19］研究表明miR-196b-5p 通過下調COL1A1 可抑制乳腺癌細胞的生長和轉移。LI 等［20］報道，miR-196b 在肺癌組織和細胞中高表達，miR-196b 可以通過下調GATA6 增強肺癌細胞的遷移和侵襲。以上研究提示，miR-196b 可能參與調控多種癌癥的發生發展過程。miR-196b作為一種miRNA 分子，在宮頸癌的發生發展中也起著重要作用［21］，但是有關miR-196b與宮頸癌關系的研究報道較少。本研究結果顯示，與HeLa 細胞相比，HeLa/DDP 細胞miR-196b 表達顯著升高，表明miR-196b 在耐藥宮頸癌細胞中表達上調，miR-196b 可能在一定水平上促進細胞耐藥；隨順鉑濃度增加HeLa/DDP、HeLa 細胞活力下降，經計算HeLa 對順鉑的IC50為4.86 μmol/L，HeLa/DDP對順鉑的IC50為68.13 μmol/L，與HeLa 相比，HeLa/DDP 對順鉑的IC50顯著升高，提示HeLa/DDP 對順鉑的耐藥性遠大于HeLa；與空白對照+DDP組、陰性對照+DDP 組相比，轉染后24 h、48 h，miR-196b inhibitor-2+DDP組細胞中miR-196b表達水平均明顯減少，表明下調基因miR-196b順鉑耐藥宮頸癌細胞株構建成功，其中以轉染48 h 后miR-196b inhibitor-2+DDP組細胞中miR-196b表達水平最低，因此選miR-196b inhibitor-2+DDP 組轉染后48 h 進行后續研究。本研究通過利用構建好的miR-196b inhibitor-2 細胞，探索miR-196b 基因的下調對HeLa/DDP 細胞對順鉑耐藥性的影響，結果顯示，與空白對照+DDP組、陰性對照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細胞IC50顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，表明下調miR-196b 可增加HeLa/DDP 細胞對順鉑的敏感性，降低其耐藥性，促進細胞凋亡。

PI3K 屬于機體細胞內重要磷脂酰肌醇激酶之一，由1 個催化亞基和1 個調節亞基組成，可作為關鍵信號分子參與機體多種生理活動［22］。Akt 則為PI3K 下游直接靶蛋白，屬于一種原癌基因c-Akt 過表達產物，當PI3K被激活后，促進AKT發生磷酸化，活化的Akt可進一步促進其下游多種酶和轉錄因子發生磷酸化作用，進而調節細胞功能。研究表明，PI3K/Akt通路可調控多種細胞生理信息傳導，參與機體內各種生命活動［23］。多項研究表明PI3K/Akt 信號通路與宮頸癌疾病進展具有重要關系，BAHRAMI等［24］表明PI3K/Akt/mTOR 信號通路在宮頸癌預后評估中具有重要價值；HUANG 等［25］報道基因FOXC1 可通過PI3K-AKT 信號通路促進宮頸癌的細胞增殖和上皮間質轉化；DONG 等［26］發現依維莫司和紫杉醇可通過靶向PI3K/AKT/mTOR 途徑誘導宮頸癌細胞的凋亡，提示PI3K/Akt信號通路可能參與調控宮頸癌的發生發展過程，但是其與宮頸癌細胞順鉑耐藥性的關系目前尚不清楚。本研究結果顯示，與空白對照+DDP 組、陰性對照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP組細胞p-Akt、PI3K、pmTOR 蛋白表達水平均明顯減少，Akt蛋白水平差異無統計學意義，表明下調基因miR-196b可抑制Akt、mTOR 蛋白磷酸化，抑制PI3K/Akt 信號通路的激活，推測下調基因miR-196b 可能通過抑制PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達，進而增加HeLa/DDP細胞對順鉑的敏感性，降低其耐藥性，促進宮頸癌細胞凋亡。

綜上所述，下調基因miR-196b 可增加HeLa/DDP 細胞對順鉑的敏感性，降低其耐藥性，可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路活化，進而誘導細胞凋亡，為逆轉宮頸癌細胞化療耐藥性及基因靶向治療提供了新思路，但本研究未對miR-196b具體通過靶向哪些基因進而調控PI3K 通路進行深入分析，且miR-196b 在體內與宮頸癌細胞順鉑耐藥的關系尚不清楚，有待進一步深入探討。