肝癌細胞來源細胞外囊泡通過誘導外周血單個核細胞分泌IL-6抑制T細胞功能①

陳永強 鄭 璐 王 鵬 王 露 張 玥 陳艷紅 周 娟 牛國平

（徐州市中心醫院檢驗科，徐州 221009）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在消化系統腫瘤中較為常見，其發生機制與病毒感染或慢性炎癥等密切相關，特別是炎癥因子IL-6 與肝癌的發生、發展及患者預后關系密切［1］。研究證實，在腫瘤的發展過程中，腫瘤細胞通過釋放多種生物活性物質誘導微環境中間質細胞和巨噬細胞等發揮抑制腫瘤特異性T 細胞功能，進而促進腫瘤的免疫逃逸［2-5］。其中，腫瘤來源的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由腫瘤細胞釋放入外周循環的囊泡，因其富含各種蛋白配體、脂質和非編碼RNAs 等活性物質參與誘導腫瘤免疫抑制微環境的形成［2-6］。因此，本研究旨在探討肝癌細胞來源的EVs 體外對外周血中單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中T 細胞功能的影響及其機制，為今后臨床肝癌免疫治療提供新的靶點和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和臨床標本來源 C57BL/6小鼠，雌性6～8 周齡，購自揚州大學實驗動物中心；IL-6敲除的C57BL/6 小鼠由蘇州大學張進平教授惠贈；人肝癌患者外周血和胸腹水標本來源于徐州市中心醫院，該研究通過徐州市中心醫院臨床研究倫理委員會的審查（XZXY-LJ-20200521-018）。

1.1.2 主要試劑和儀器 小鼠和人淋巴細胞分離液購自杭州聯科生物（70-MLSM1092、70-LSM02）；小鼠和人IL-2（200-02、212-12）、CD3 Monoclonal Antibody（05121-20、05122-20）和CD28 Monoclonal Antibody（10311-20、10312-20）購自PeproTech 公司；RPMI1640和DMEM培養基（8120133，8120124）購自Gibco 公司；胎牛血清（11011-8611）購自浙江天杭生物公司；Anti-mouse CD4-APC（100516）、Anti-mouse CD8-FITC（100706）、Anti-mouse IFN-γ-PE（505808）、Anti-human CD4-APC（300514）、Anti-human CD8-APC（301014）、Anti-human IFN-γ-PE（502509）和小鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒（431304）購自Biolegend 公司；人IL-6 和IFN-γ 細胞因子流式熒光微球檢測試劑盒（20180013）購自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司；人IL-6中和抗體購自R&D公司（AF-206-NA）；細胞固定破膜劑（555414）、細胞因子刺激劑阻斷劑（550583）、流式細胞儀（FACS Calibur）均購自BD 公司；粒徑分析儀（Zetasizer Pro）購自Malvern PANalytical 公司；透射電子顯微鏡（JEM-1011）購自JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細胞來源EVs 的提取與粒徑分析 小鼠腫瘤細胞株（Hepa1-6、EL4、B16F10 和LLC）和人肝癌細胞株（HepG2、HuH-7和Hep3B）均采用DMEM完全培養基進行傳代培養。收集上述腫瘤細胞培養上清，1 000 g 離心10 min 去除細胞及細胞碎片，然后將上清于12 000 g、4℃條件下離心30 min，隨后用PBS 將沉淀物洗滌2 次后即為腫瘤細胞來源的EVs。將小鼠肝癌Hepa1-6 和人肝癌HepG2 細胞株來源的EVs 重懸于PBS 中，采用粒徑分析儀進行檢測分析；將兩株細胞來源的EVs 高速離心使其壓縮緊密，棄上清后，經固定、包埋、切片和染色后，采用透射電鏡進行觀察拍照。

1.2.2 小鼠和人PBMCs 的分離 無菌條件下取C57BL/6小鼠肝素抗凝外周血和健康人肝素抗凝外周血，分別采用小鼠和人外周血淋巴細胞分離液按照操作說明進行分離，獲得小鼠外周血單個核細胞（mPBMCs）和人外周血單個核細胞（hPBMCs）。

1.2.3 檢測小鼠腫瘤細胞來源EVs 對mPBMCs 分泌IL-6 及T 細胞分泌IFN-γ 的影響 將方法1.2.2中分離獲得的mPBMCs 重懸于含有小鼠重組IL-2、抗CD3 抗體、抗CD28 抗體和胎牛血清的1640 完全培養基中，分別加入24 孔板中，1×106個/（ml·孔），然后加入不同濃度的EVs（0、1、3和10 μg/ml），培養72 h后收集細胞培養上清并按照小鼠IL-6 ELISA 檢測說明書檢測各組IL-6 的分泌水平；采用流式細胞儀檢測CD4+T 和CD8+T 細胞分泌IFN-γ 的比例，具體檢測步驟：收集細胞前5 h 加入細胞因子刺激阻斷劑2 μl/ml，細胞用PBS 洗滌1 次，每管細胞加入2 μl 的CD4-APC 和anti-mouse CD8-FITC 室溫染色20 min 后，用PBS 洗滌1 次，渦旋重懸細胞后加入250 μl 的細胞固定-破膜劑進行固定破膜20 min，PBS 洗滌1 次后加入2 μl 的anti-mouse IFN-γ-PE 室溫染色30 min，PBS 洗滌1 次，重懸于0.5 ml 的PBS中。采用流式細胞儀檢測分析，試驗重復3次。

1.2.4 檢測人肝癌細胞來源EVs 對hPBMCs 分泌IL-6 及T 細胞分泌IFN-γ 的影響 將方法1.2.2 中分離獲得的hPBMCs重懸于含有人重組IL-2、抗CD3抗體、抗CD28 抗體和胎牛血清的1640 完全培養基中，分別加入24 孔板中，2×106個/（ml·孔），然后加入3 μg/ml 的肝癌細胞株和肝癌患者腹水來源的EVs 或聯合加入50 ng/ml 的IL-6 中和抗體，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，培養72 h后采用流式細胞儀檢測細胞培養上清中IL-6 和IFN-γ 的分泌水平，具體檢測步驟：首先向流式管中分別依次加入25 μl 的實驗緩沖液、捕獲微球抗體、每組細胞培養上清標本和檢測抗體，室溫避光振蕩孵育2 h，向所有管中加入25 μl SA-PE，繼續室溫避光振蕩孵育0.5 h，然后每管中加入500 μl 1×洗滌緩沖液，渦旋數秒，500 g 離心5 min，緩慢傾倒出液體，再向每管中加入200 μl洗滌緩沖液，渦旋10 s將微球重懸，立即上機檢測；而IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細胞的比例檢測方法參照方法1.2.3，試驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用GraphPad 8 軟件進行數據處理，數據以表示，多組間比較采用One-Way ANOVA 和Tukey-Kramer 檢驗；兩組間比較使用非配對Student'st檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌細胞來源EVs粒徑分析 采用粒徑分析儀檢測分析小鼠肝癌Hepa1-6和人肝癌HepG2細胞株來源的EVs，結果顯示：小鼠肝癌Hepa1-6細胞株來源的EVs 直徑主要分布于150～1 000 nm 之間，平均直徑為（250.5±60.85）nm（圖1A、C）；而人肝癌HepG2細胞株來源的EVs直徑也主要分布于150～1 000 nm之間，平均直徑為（301.6±84.92）nm（圖1B、D）。

圖1 肝癌細胞來源的EVs粒徑分析和形態觀察Fig.1 Particle size distribution and morphological observation ofisolated EVs from hepatocellular carcinoma cells

2.2 小鼠肝癌細胞來源的EVs 抑制T 細胞分泌IFN-γ 檢測T細胞分泌IFN-γ的水平是評估其功能的重要指標。mPBMCs 經不同濃度的小鼠肝癌Hepa1-6 細胞來源的EVs（0、1、3、10 μg/ml）誘導培養72 h后，流式細胞術檢測結果顯示：隨著EVs濃度增加，IFN-γ+CD4+T 細胞和IFN-γ+CD8+T 細胞的比例均顯著低于對照組（圖2）。提示：小鼠肝癌Hepa1-6細胞來源的EVs 體外可顯著抑制T 細胞分泌IFN-γ的功能。

圖2 小鼠肝癌細胞來源EVs對效應T細胞分泌IFN-γ的影響Fig.2 Effect of EVs derived from mouse hepatocarcinoma cells on IFN-γ secretion by effector T cells

2.3 小鼠肝癌細胞來源的EVs 誘導mPBMCs 分泌IL-6 將不同濃度的小鼠肝癌Hepa1-6 細胞來源的EVs（0、1、3、10 μg/ml）分別與mPBMCs 共培養72 h后，ELISA 檢測結果顯示，1 μg/ml 的EVs 即可顯著誘導IL-6分泌，隨著EVs濃度的增加，IL-6的分泌量也顯著增高（圖3A）。另外，小鼠B16F10、EL4 和LLC 細胞來源的EVs 均可顯著誘導mPBMCs 分泌IL-6，其中Hepa1-6細胞來源的EVs誘導IL-6的分泌量最高（圖3B）。300 μl的小鼠肝癌Hepa1-6細胞培養上清（culture media，CM）以及等體積培養上清高速離心獲得的EVs 可以顯著促進mPBMCs 分泌IL-6，而300 μl 通過高速離心去除EVs 的培養上清（EVs-depleted CM）誘導mPBMCs分泌IL-6的量顯著降低（圖3C）。以上結果提示：小鼠肝癌Hepa1-6 細胞來源的EVs 是誘導mPBMCs 分泌IL-6 的關鍵物質。

圖3 小鼠肝癌細胞來源EVs誘導mPBMCs分泌IL-6Fig.3 Mouse hepatocellular carcinoma cell-derived EVs induce mPBMCs to secrete IL-6

2.4 小鼠肝癌細胞來源的EVs 通過誘導PBMCs 分泌IL-6 抑制T 細胞分泌IFN-γ 為了證明小鼠肝癌細胞來源EVs抑制T 細胞分泌IFN-γ 是否通過IL-6，將3 μg/ml 小鼠肝癌細胞來源的EVs 分別與野生型（wild type，WT）mPBMCs和IL-6敲除（knock out，KO）mPBMCs共培養72 h后，流式細胞術檢測結果顯示：小鼠肝癌Hepa1-6 細胞來源的EVs 可顯著抑制WT mPBMCs 中CD4+T 細胞和CD8+T 細胞分泌IFN-γ；而在IL-6 KO 的mPBMCs 中，小鼠肝癌細胞來源的EVs對CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ無抑制作用，相反可以顯著促進CD4+T 細胞分泌IFN-γ（圖4）。以上結果提示：小鼠肝癌Hepa1-6 細胞來源的EVs主要通過誘導mPBMCs 分泌IL-6 發揮抑制T 細胞分泌IFN-γ的作用。

圖4 小鼠肝癌細胞來源EVs通過誘導PBMCs分泌IL-6發揮抑制T細胞分泌IFN-γ的作用Fig.4 Mouse hepatocellular carcinoma cell-derived EVs can effectively inhibit T-cell IFN-γ secretion via IL-6 secreted by PBMCs

2.5 人肝癌細胞來源EVs 通過誘導hPBMCs 分泌IL-6 抑制T 細胞分泌IFN-γ 為進一步證明上述結果，首先檢測發現12 例臨床原發性肝癌患者（liver cancer patients，LCPs）外周血中IL-6 水平顯著高于健康志愿者（healthy donors，HDs）（圖5A）。隨后，將從3 株人肝癌細胞（HepG2、HuH7 和Hep3B）培養上清中分離的EVs（LCC-EVs）和5 例肝癌腹水中分離的EVs（LCA-EVs）分別與hPBMCs 共培養72 h，流式細胞術檢測結果顯示：LCC-EVs 和LCA-EVs 均可顯著誘導IL-6 的分泌和抑制IFN-γ 的分泌（圖5B～D）；當上述LLC 和LCA 來源的EVs 分別聯合加入IL-6 中和抗體（αIL-6）時，EVs 抑制的IFN-γ 又顯著恢復（圖5C、D）。提示：人肝癌細胞來源的EVs也通過誘導hPBMCs 分泌IL-6 發揮抑制T 細胞分泌IFN-γ的作用。

圖5 人肝癌細胞來源EVs 通過誘導分泌IL-6 發揮抑制T細胞分泌IFN-γ的作用Fig.5 Human hepatocellular carcinoma cell-derived EVs can inhibit T-cell IFN-γ secretion via IL-6

3 討論

EVs 主要由直徑30～150 nm 的外泌體和150～1 000 nm 的微泡組成，是細胞間重要的信號傳遞媒介［7］。本研究通過差速離心獲得肝癌細胞來源的EVs 粒徑主要分布于150～1 000 nm 之間。文獻報道，腫瘤細胞來源的外泌體通過HSP72/TLR2-MyD88 誘導MDSCs 分泌IL-6 繼而活化stat3 信號通路增強其免疫抑制功能［8］；同時，腫瘤來源外泌體通過膜分子HSP72/HSP105 與TLR2/4 相互作用誘導DC 分泌IL-6 促進腫瘤細胞分泌MMP-9 實現遠端轉移［9］。而最新研究發現，外泌體膜表面PD-L1與PD-1相互作用直接發揮抑制T 細胞的功能［4，10］。與既往文獻報道基本一致，本研究結果顯示，肝癌細胞來源的EVs 體外可以誘導PBMCs 分泌高水平的IL-6，同時也可以顯著抑制T細胞分泌IFN-γ。

文獻報道IL-6 是一種多效性的細胞因子，不僅可以促進機體的炎癥反應，也可以發揮抗炎作用［11］。在促炎方面，IL-6 主要通過誘導抗凋亡蛋白Bcl-2 和抑制Fas/FasL 的表達促進CD4+T 細胞的存活和增殖［12］。與之相反，在抑制炎癥反應方面，主要通過抑制Th1 細胞的分化及CD8+T 細胞的功能［13-14］。本實驗結果顯示，小鼠肝癌細胞來源的EVs 可以誘導野生型小鼠PBMCs 分泌IL-6 并抑制T細胞分泌IFN-γ，而在IL-6 缺陷的小鼠PBMCs 中，EVs 對CD8+T 細胞分泌IFN-γ 無影響，相反可以促進CD4+T 細胞向Th1 方向分化；而在人PBMCs 中，當聯合加入IL-6 中和抗體后，可顯著恢復人肝癌細胞來源的EVs 對T 細胞分泌IFN-γ 的抑制作用。結果說明，肝癌細胞來源的EVs 體外主要通過誘導分泌IL-6發揮抑制T細胞分泌IFN-γ的功能。

綜上，本研究證明小鼠和人肝癌細胞來源的EVs 粒徑主要分布于150～1 000 nm 之間，體外主要通過誘導分泌IL-6 發揮抑制T 細胞分泌IFN-γ 的功能，該研究結果為后期臨床肝癌患者聯合IL-6 中和抗體治療提供一定的實驗依據。然而，關于肝癌細胞來源的EVs攜帶何種關鍵功能分子及其詳細的調控機制有待深入研究。