艾納香不同提取物GC-MS分析及其抑菌活性

胡 璇，王 凱，于福來 ，王 丹，謝小麗，龐玉新 ，陳鴻發

（1. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/海南省艾納香工程技術研究中心，海南 海口 571101；2. 廣東藥科大學中藥資源學院，廣東 云浮 527500；3. 海南艾納香生物科技發展股份有限公司，海南 海口 570208）

0 引言

【研究意義】口腔的感染性疾病如齲齒、牙齦炎、牙周炎、牙齦膿腫、口臭等都與口腔厭氧菌致病密切相關，西藥雖然能迅速緩解口腔不適癥狀，但長期使用易產生耐藥性和不良作用。大量研究顯示，許多中草藥提取物具有較好的體外抑菌作用，又很少使病原菌產生抗藥性，因此在控制細菌感染性疾病方面具有獨特的優勢[1-2]，尋找天然、安全、對口腔細菌具有良好抑菌作用的中草藥提取物是目前口腔疾病防治研究的重點。【前人研究進展】艾納香為菊科（Asteraceae）艾納香屬（Blumea）植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的新鮮或干燥地上部分，氣味芳香，具有抗菌消炎、祛風除濕、清熱解毒、清咽利喉的功效[3]。艾納香作為我國傳統中草藥藥品原料，主要分布于海南、貴州、廣東、廣西等省（區）。艾納香油、艾粉和艾片均是艾納香主要提取物，艾粉是艾納香的葉和枝經水蒸氣蒸餾提煉出來的粗加工品，作為原料前體物可進一步加工得到艾片，在精制艾片的過程中粗提物經壓榨分離而得到的油即為艾納香油[4]，其中艾片是中華人民共和國藥典收載品種，是常用藥物天然冰片的來源之一，其含有的左旋龍腦成分為藥典規定的唯一指標性成分[5]。查閱近年來艾納香化學成分和抑菌相關文獻，主要集中于黃酮類、艾納香揮發油等提取部位的化學成分分析和大部分常見需氧菌的抑菌作用研究[6-7]。李安等[8]研究發現微波輔助提取的艾納香油對5種受試細菌和真菌具有較強的抗菌能力，對真菌的抑制效果明顯強于細菌，其中對黃曲霉的抑制效果最佳。Sakee等[9]采用圓盤擴散法和瓊脂微稀釋法評估艾納香不同溶劑提取物的抑菌活性，發現艾納香油抑菌效果最佳，對蠟樣芽孢桿菌的MIC為150 μg·mL-1，對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC為1.2 mg·mL-1。聞慶等[10]證實提取艾納香油和艾片殘留的艾渣不同萃取部位同樣具有較好的體外抗菌活性，尤以三氯甲烷萃取部位對乙型溶血性鏈球菌和大腸埃希菌的抑制作用顯著。【本研究切入點】目前，同時對艾納香3種提取物進行綜合GC-MS分析以及綜合活性評價分析，并對其口腔常見厭氧菌的抑菌性的相關研究仍較少。【擬解決的關鍵問題】本研究對艾納香葉的3種主要提取物艾納香油、艾粉和艾片采用GC-MS技術分析其成分，并分別對4株口腔臨床常見厭氧菌變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌進行體外抑菌活性研究，旨在為天然藥用植物艾納香的開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器設備

艾納香油、艾粉和艾片均源自貴州羅甸同批艾納香藥材提取物，經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所于福來副研究員鑒定均為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的不同提取物。變形鏈球菌標準株（Streptococcus mutans，ATCC25175）、具核梭桿菌標準株（Fusobacterium nucleatum，ATCC10953）、牙齦卟啉單胞菌標準株（Porphyromonas gingivalis，ATCC33277）、中間普氏菌標準株（Prevotella intermedia，ATCC25611）均由成都里來生物科技有限公司分子生物檢驗室提供。兔血腦心浸出液肉湯（BHI）培養基（上海源葉生物科技有限公司），厭氧肉肝湯（北京索萊寶科技有限公司）。

7890A/5975C GC/MS聯用儀（美國Agilent公司），XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新風醫療器械有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州廣源凈化科技有限公司），DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱（上海申苗醫療器械制造有限公司），厭氧培養罐（日本三菱公司），Sartarius CPA225D電子分析天平［賽多利斯（北京）科學儀器有限公司］，DU-800紫外-可見光分光光度計（美國貝克曼公司），SpectraMax Plus384酶標儀（美國Molecular Devices公司），氨芐青霉素（福州飛凈生物科技有限公司，批號：181120），二甲基亞砜、95%乙醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），水為滅菌蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 艾納香提取物化學成分分析 采用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對艾納香3種提取物艾納香油、艾粉和艾片進行化學成分分析[11]。精密量取艾納香油100 μL，精密稱取艾粉和艾片50 mg，均用二氯甲烷溶解并定容至10 mL，過0.45 μm濾膜即得上機樣品。GC條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣為高純氦氣（99.99%），載氣流量1.0 mL·min-1，不分流進樣，進樣口溫度260 ℃，初始溫度50 ℃保持1 min；以3 ℃·min-1升至200 ℃，保持5 min；以2 ℃·min-1，升至260 ℃，保持10 min。MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度260 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，掃描范圍20～450 amu，進樣量1.0 μL。樣品經氣相色譜質譜分析，各分離組分采用NIST17譜庫進行檢索，并結合人工解析和參考文獻分析確定各化學成分，相對含量采用色譜峰面積歸一化法計算。

1.2.2 供試菌懸浮液的制備 將低溫保存的標準菌株變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌各取50 μL接種至兔血BHI培養基中，劃線使其能形成單個菌落，將接種平板放至厭氧箱中（80% N2，10% H2，10% CO2）培養3 d活化。然后挑取平板菌落接種至厭氧肉肝湯中培養72 h，紫外分光光度計測定菌液濃度OD600nm為0.5～1.0，檢驗純度后用相應的培養液將菌液稀釋成1×107CFU·mL-1的菌懸液備用。

1.2.3 藥敏試驗 將艾納香油（油狀藥物）與95%乙醇進行溶解稀釋，體積比為666.7 μL·mL-1，艾粉、艾片用95%乙醇分別配制成2 g·mL-1的基礎藥物溶液，試驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌，采用管碟法進行測定[12-13]。按無菌操作法，吸取備好的4種厭氧菌菌液200 μL至BHI培養基表面，用無菌棉簽涂布均勻，室溫放置2～3 min，待平板表面菌液吸收后，將直徑約為6 mm無菌牛津杯固定于培養基上，并標記好各藥物的名稱，每個培養基可放置3個牛津杯。再用移液槍在每個牛津杯中分別加各提取物藥液50 μL，每個菌種重復3次，置37 ℃厭氧條件下培養3～5 d后，觀察并記錄抑菌圈的有無以及直徑大小作為判斷敏感度高低的標準，并用游標卡尺分別測量每個抑菌圈直徑大小，取其平均值作為測定結果。結果判定按《藥理實驗方法學》標準[14]：抑菌圈直徑＜10 mm為抗藥，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 將“1.2.3”中艾納香油基礎藥物溶液5倍稀釋至133.34 μL·mL-1，艾粉和艾片5倍稀釋至400 mg·mL-1。采用微量肉湯稀釋法[15]，取96孔微量板，在無菌操作下用移液槍向每排11孔各加入100 μL厭氧肉干湯培養基，再吸取100 μL稀釋后的3種提取物藥液至第一孔，以第一孔艾納香油體積比為66.7 μL·mL-1、艾粉和艾片質量濃度為200 mg·mL-1作為起始濃度采用對倍稀釋法稀釋成相應濃度，第10孔中吸取100 μL棄去，此為試驗組。吸取100 μL配置好的菌懸液依次加入第1～11孔中，充分混勻。第11孔不加試藥，以便觀察培養基是否適合菌株生長，為生長對照組，吸取200 μL厭氧肉干湯肉湯培養基加入到第12孔以便觀察培養基否被污染。共4種口腔常見厭氧菌細菌（變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌），每種細菌3個重復。隨后將96微孔板放置于37 ℃厭氧培養24 h。取出后采用酶標儀測定OD600nm，與陰性對照組比較，抑菌率達到80%的樣品濃度就為該受試菌的MIC。氨芐青霉素（AMP）和95%乙醇作相同處理分別作為陽性藥物對照和陰性溶劑對照。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測定 采用瓊脂培養基平板法[14]，將MIC濃度及上下各一個濃度組的上述混合液各取出20 μL均勻涂布在的血平板相應區域內，厭氧培養48 h，觀察有無細菌生長，以無菌生長對應相應孔中的最低濃度即為3種提取物對4種厭氧菌的MBC。

2 結果與分析

2.1 艾納香提取物化學成分GC-MS分析

在“1.2.1”項條件下進樣，得到艾納香油、艾粉和艾片的總離子流圖（圖1）。所得3種提取物各組分的質譜數據經計算機檢索標準譜庫，采用峰面積歸一化法測定了各組分的百分含量，將其進行分析比較，結果見表1～3。結果顯示艾納香油、艾粉和艾片經GC-MS分析分別鑒別出56、19和8種化合物（相對含量低于0.10%沒有列出），已鑒定的成分分別占總峰面積的73.20%、92.25%和96.93%。3種提取物僅含有左旋龍腦1個共有成分，艾納香油、艾粉和艾片中左旋龍腦相對含量分別為13.36%、81.40%和76.07%；艾納香油和艾粉還同時含有成分silphiperfol-5-ene。艾納香油的化學組分相對較為復雜，主要為萜類化合物，大部分為單萜和倍半萜類，少量二萜和三萜類，相對含量較高的有長葉烯-（V4）（13.45%）、左旋龍腦（13.36%）、合成樟腦（7.18%）以及纈草稀醛-4,7（11）二烯（7.66%）。艾粉和艾片中化學組分相對簡單，大部分也以萜類化合物為主，左旋龍腦相對含量較高，分別為81.40%和76.07%，兩種提取物中含量僅次于左旋龍腦的成分分別為左旋樟腦（8.27%）和右旋樟腦（20.53%）。

表1 艾納香油中化學組成成分Table 1 Chemical composition of blumea oil

圖1 艾納香油（A）、艾粉（B）和艾片（C）的總離子流色譜圖Fig. 1 GC-MS total ionic current chromatograms of blumea oil(A), blumea powder (B), and blumea camphor (C)

2.2 藥敏試驗

艾納香油、艾粉和艾片對4種指示菌的抑菌圈直徑見表4。由表4結果可知3種艾納香提取物對變形鏈球菌、具核梭桿菌、中間普氏菌均有一定的抑菌活性，全部藥敏牛津杯周圍都出現了大小不等的邊界清晰的抑菌圈，除牙齦卟啉單胞菌外，對其他菌株抑菌圈均大于10 mm，表現出一定的藥敏性；3種提取物對牙齦卟啉單胞菌無明顯的抑制作用，艾納香油無抑菌圈出現，艾粉和艾片僅有一個重復出現了抑菌圈。由于艾納香油是按照體積濃度進行試驗，根據課題組前期試驗結果和文獻可知[4]，艾納香油與水的相對密度基本上接近1，按照密度進行換算可知其藥敏試驗質量濃度為666.7 mg·mL-1，相對于艾粉和艾片質量濃度（2 g·mL-1），其濃度相對較低，但表現出的藥敏作用無明顯差異，均屬于中度敏感。由此可知，艾納香油對中間普氏菌、變形鏈球菌、具核梭桿菌的抑菌敏感度強于艾粉和艾片。

表4 3種艾納香提取物對4株厭氧菌的平均抑菌圈直徑測定結果Table 4 Average antibacterial circle diameters of blumea products on 4 oral anaerobes

2.3 MIC值和MBC值測定

MIC和MBC結果中艾納香油均按照水的密度進行換算，由表5結果可知艾納香油、艾粉和艾片對4株口腔厭氧菌表現出不同程度的抑制作用，MIC在8.34～100 mg·mL-1，艾納香油的抑菌和殺菌效果最強（MIC、MBC分 別 在8.34～16.68、33.35～133.4 mg·mL-1），艾粉和艾片的抑菌和殺菌效果并無明顯差異。3種提取物對具核梭桿菌抑菌效果最佳，艾納香油、艾粉和艾片的MIC值分別為16.68 mg·mL-1，50 mg·mL-1，50 mg·mL-1，MBC值 分 別 為33.35 mg·mL-1，50 mg·mL-1，50 mg·mL-1。艾粉和艾片對牙齦卟啉單胞菌、艾粉對變形鏈球菌、艾片對中間普氏菌的MBC值均大于200 mg·mL-1，殺菌效果均不理想。其中陽性對照藥物氨芐青霉素（AMP）對4株厭氧菌表現出了強抑菌效果，陰性對照95%乙醇無抑菌作用。

表5 3種艾納香提取物對4株厭氧菌的MIC和MBC測定結果Table 5 MICs and MBCs of blumea products against 4 oral anaerobes （單位：mg·mL-1）

3 討論與結論

由于口腔細菌耐藥性問題使得中草藥代替西藥在口腔領域的研究越發迫切，近年來，在中草藥抑制主要致齲菌、牙周致病菌等方面開展了大量的研究工作。研究表明，茶多酚[16]、黃芩[17]、五倍子[18]、厚樸[19]等中草藥及其制劑具有良好抑制口腔細菌的活性，充分說明中草藥來源的活性成分應用于口腔疾病的預防和治療具有良好的開發利用潛力。艾納香油、艾粉和艾片為中草藥艾納香中3種主要提取物，通常采用工業水蒸氣蒸餾法可在同一工藝下獲得。艾納香油價格相對艾片較為便宜，鑒于其良好的生物活性，目前已被收錄于國際化妝品目錄中，艾納油作為主要抑菌劑和抗氧劑廣泛應用于日化用品中[20]，而艾粉作為最初的粗提物，其應用相對較少。雖然艾納香富含揮發油成分，但主要用途依然是精制天然冰片（艾片），在提取的過程中可得到艾納香油和艾粉。目前艾片作為天然冰片的一種，價格極其昂貴，常用作“引藥及佐藥”，在心腦血管中成藥中有較多與其配伍應用[21]。

表2 艾粉中各化學成分Table 2 Chemical composition of blumea powder （±s, n=3）

表2 艾粉中各化學成分Table 2 Chemical composition of blumea powder （±s, n=3）

序號No.化合物 Compounds 保留時間Retention time/min化學式Chemical formula分子質量Molecular mass相對含量Relative amount/%1 2-蒈烯 2-carene 8.05 C10H16 136.125 0.382 月桂烯 Beta.-myrcene 9.09 C10H16 136.125 0.323 左旋樟腦 l--camphor 16.47 C10H16O 152.12 8.274 左旋龍腦 l-borneol 18.49 C10H18O 154.136 81.405 Silphiperfol-5-ene 24.18 C15H24 204.188 0.226 1,1′-（4,6-二羥基苯）二乙酮 4,6-diacetyl-1,3-benzenediol 28.81 C10H10O4 194.058 0.137 silphiperfol-6-en-5-one 36.62 C15H22O 218.167 0.268 4′,6-二甲基-2-羥基苯乙酮 xanthoxylin 39.70 C10H12O4 196.074 0.189 （3S,3aS,6R,7R,9aS）-1,1,7-trimethyldecahydro-3a,7-methanocyclopenta[8]annulene-3,6-diol 47.39 C15H26O2 238.193 0.4110 2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）phenol,2,2′-methylenebis[6-（1,1-dimethylethyl）-4-methyl- 67.49 C23H32O2 340.24 0.14

表3 艾片中各化學成分Table 3 Chemical composition of blumea camphor

艾納香3種提取物應用不同，這與其提取工藝造成的化學成分差異具有密切的關系。艾納香油雖然左旋龍腦含量最低，但是其化學組分相對較為豐富，其含有的β-蒎烯、樟腦、芳樟醇等活性成分，具有鎮痛、消炎和抗菌等藥理活性[4]。目前尚無相關文獻對粗提物艾粉進行相關活性研究。本研究發現艾粉對口腔致病菌具有一定的抑制作用，后續加強對艾粉中多種成分的定性定量分析將有助于其生物活性的深入探討。艾片中雖然化學成分相對較少，但是左旋龍腦含量最高，且純度高。Yu等[22]研究發現左旋龍腦能增加皮膚透皮性吸收，提高血腦屏障及黏膜的通透性，故艾片對調節中樞神經系統和保護腦組織具有良好的效果。本研究中3種提取物對4株口腔厭氧菌均有不同程度的抑菌作用，艾納香3種提取物中均含有大量的萜類化合物，萜類化合物往往具有較強的抑菌效果，據報道可知其中含量較高的左旋龍腦對多種致病菌都有抑制作用表現出良好的抑菌作用[23]。3種提取物中艾納香油的抑菌效果最佳，充分說明各有效成分通過相同或不同的作用機制，或協同或拮抗最終產生的藥效比單一成分產生的藥效更為顯著[24]。

本研究首次同時研究艾納香中3種重要提取物對口腔厭氧菌的抑菌活性，3種提取物對具核梭桿菌抑菌效果最強，具核梭桿菌是牙周炎的主要致病厭氧菌之一，其產生的內毒素還能促發炎癥微環境作用，同時與胃腸道腫瘤的發生有著密切的關系[25]。研究結果為后續艾納香提取物在口腔領域的應用提供了一定的理論依據，但其對口腔致病厭氧菌的抑菌機制還有待于進一步研究。