鴨IFN-β mRNA SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

方鐵輝，董 慧,2，肖世峰,2，王 劭,2，程曉霞,2，林鋒強,2，朱小麗,2，陳秀琴,2，鄭 敏,2，陳仕龍,2 ，陳少鶯,2

（1. 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013；2. 福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】干擾素（Interferon，IFN）是宿主細胞分泌的一類廣譜的抗病毒細胞因子，在抗病毒感染的天然免疫反應中發揮重要作用。IFN根據其結合的受體不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種基本類型，其中Ⅰ、Ⅲ型干擾素與天然免疫密切相關，Ⅰ型干擾素來源廣泛，幾乎所有的細胞均能產生，主要包括IFN-α和IFN-β[1]。宿主為了抵御病毒的入侵，上調表達IFN-β等Ⅰ型、Ⅲ型干擾素，迅速啟動抗病毒天然免疫應答；而病毒為了能夠持續感染和致病，往往進化出拮抗或逃逸宿主天然免疫的功能[2]。檢測宿主細胞干擾素的表達水平能反應宿主的天然免疫狀態，為評價宿主的抗病毒水平及研究病毒拮抗宿主天然免疫的功能提供依據。【前人研究進展】國內外對鴨IFN-α的克隆、表達、檢測及功能研究有較多報道[3-5]，而鴨IFN-β的克隆、表達及抗病毒活性研究較少。高全新等[6]建立了基于熒光素酶雙報告基因系統測定鴨IFN-β的表達水平的檢測方法，一些學者用qPCR檢測了禽坦布蘇病毒等水禽病毒感染宿主后IFN-β及天然免疫相關基因mRNA相對轉錄水平[7-8]。【本研究切入點】實時熒光定量RT-PCR常用于基因的mRNA表達水平的檢測，不僅能夠準確對表達量進行定量，而且操作簡便、快速[9-10]。準確定量測定鴨IFN-β mRNA表達水平的熒光定量PCR方法目前仍少有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究旨在建立一種用于檢測鴨IFN-β mRNA表達水平的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR方法，為檢測鴨體內和細胞中IFN-β mRNA轉錄水平提供一種有效的檢測手段，也為研究病毒感染與宿主天然免疫應答的互作研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無菌采集7日齡健康櫻桃谷鴨脾臟、肝臟及胰腺，無菌Hank’s液研磨成勻漿，-70 ℃保存備用；原核表達載體pET-30a由本實驗室保存；DH5α購自北京全式金生物技術有限公司（全式金）；鴨胚成纖維細胞傳代細胞系（DEFs）購自美國ATCC細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

CFX 96熒 光 定 量PCR儀（Bio-Rad）、梯度PCR儀（Bio-Rad），RT-PCR反轉錄試劑盒、SYBR Green Ⅰ qPCR MIX、RNA提取試劑盒及RNA純化試劑盒（全式金），DNAase（TIANGEN）、BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶（Takara），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、膠回收試劑盒（諾維贊），T4 DNA連接酶（NEB），質粒小提試劑盒（QIAGEN）。2×DreamTaqGreen PCR Master Mix（Thermo Scientific）。

1.3 引物合成

據GenBank公 布 的 鴨IFN-β（KT428159）的cDNA序列，采用Oligo 7軟件合成鴨IFN-β全長引物，并在其上、下游分別引入BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位點，在其保守序列區設計熒光定量PCR特異性引物，將擴增的IFN-β全長片段用于構建重組表達質粒，并作為熒光定量PCR陽性標準品；設計一條能特異擴增鴨IFN-β的qPCR引物，以上引物均由白鯨生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物核苷酸序列及擴增片段大小Table 1 Primer sequences and amplified fragment sizes

1.4 組織RNA提取及cDNA合成

用總RNA提取試劑盒按操作說明書分別提取鴨脾臟、肝臟、胰腺及DEFs細胞的總RNA，提取的RNA經DNAase消化后，用RNA純化試劑盒純化，溶于35 μL DEPC水，用于合成cDNA。按20 μL反應體系：總RNA 1 μg，5×Super Mix 4 μL，gDNA Remove 1 μL，加水補至20 μL，按說明書反應程序50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s合成cDNA。合成的cDNA于-20 ℃保存備用，用于常規PCR擴增IFN-β全長及熒光定量PCR檢測。

1.5 鴨IFN-β重組表達質粒的制備

用表1的Full-IFN-β-F、Full-IFN-β-R為上下游引物，脾臟組織獲得cDNA作為模板，用高保真酶做常規PCR擴增目的基因。反應體系50 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各2 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP MIX 1 μL，DNA Polymerase 1 μL，加DEPC水補至50 μL；反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變 性40 s，61.5 ℃退 火40 s，72 ℃延 伸40 s，72 ℃終延伸5 min，共進行33個循環。用凝膠回收試劑盒回收目的條帶。對回收的PCR產物及表達載體pET-30a分別用BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內切酶進行雙酶切，回收純化的雙酶切產物，并用T4 DNA連接酶將目的基因同表達載體pET-30a進行重組連接。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，卡那抗性的LB培養基上涂板，挑單菌落搖菌擴大培養，提取質粒。提取的質粒用于PCR和測序驗證，將測序驗證陽性的重組克隆質粒作為陽性標準品，用核酸濃度測定儀測定DNA濃度后，按公式copies=6.02×1023×（質量/分子質量），計算重組質粒的拷貝數，并以10倍比稀釋至下限為10-1copies·μL-1。

1.6 常規PCR及熒光定量PCR

以表1所設計的qIFNβ-F、qIFNβ-R作為引物，常規PCR反應體系：2×PCR Mix 10 μL，上、下游各1 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水7 μL，反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸5 min，共進行33個循環。qPCR反應體系20 μL：上、下游各0.5 μL，2×qPCR Super Mix 10 μL，模板cDNA 1 μL，DNA/RNA free水8 μL，反應程序：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s進行退火和延伸，共進行40個循環，而后進行熒光信號采集。

1.7 標準曲線的建立

以倍比稀釋的陽性標準質粒1×101～1×108copies·μL-1作 為 模 板，以qIFN-β-F、qIFN-β-R作為qPCR上下游引物，在熒光定量PCR儀上進行擴增及分析，并計算Ct值用于繪制標準曲線。

1.8 特異性及敏感性試驗

分別用常規PCR和熒光定量PCR驗證所設計的IFN-β qPCR引物的特異性，分析產物的熔解曲線及對產物進行核酸凝膠電泳分析，將10-1～103copies·μL-1的陽性標準質粒作為模板，用于檢測qPCR反應的檢出下限。

1.9 重復性試驗

分別用所建立的qPCR檢測方法檢測鴨脾臟、肝臟、胰腺3種不同的組織樣品mRNA表達水平，組間組內各進行3次重復性試驗，并計算變異系數。

2 結果與分析

2.1 鴨IFN-β重組質粒的構建

用Full-IFN-β-F、Full-IFN-β-R引物從鴨脾臟組織樣品中擴增出732 bp鴨IFN-β的完整基因片段（圖1-A）。構建的pET-30a-IFN-β重組表達質粒也能擴增出732 bp的目的條帶（圖1-B），重組質粒經BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切后出現732 bp的目的片段和5.4 kb左右的載體條帶（圖1-C）；將陽性克隆質粒送生工測序，測序結果與GenBank中的鴨IFN-β（KM035791）和（KT428159）核苷酸同源性分別為100%和99.77%，表明鴨IFN-β成功導入pET-30a。

圖1 鴨IFN-β全基因的PCR擴增及重組質粒的構建Fig. 1 PCR amplification of duck IFN-β and construction of recombinant plasmid

2.2 熒光定量PCR檢測

以qIFN-β-F、qIFN-β-R為引物，不同組織來源的cDNA作為模板（肝、脾、胰和DEFs），分別進行qPCR和常規PCR檢測。結果顯示，qPCR和常規PCR均能擴增出特異的165 bp預期目的片段（圖2），且qPCR產物熔解曲線單峰，熔解溫度為87.94±0.16 ℃（圖3），PCR產物序列與鴨IFN-β序列一致，證明所設計的qPCR引物特異性強，無引物二聚體及非特異擴增。

圖2 不同組織IFN-β的常規RT-PCR和熒光定量RT-PCRFig. 2 Conventional RT-PCR and qRT-PCR amplification of IFN-β in different tissues

圖3 鴨4種組織（肝、脾、胰和DEFs）IFN-β 熒光定量RTPCR熔解曲線Fig. 3 qRT-PCR melting curve of duck IFN-β

2.3 標準曲線的建立

將所構建的 pET-30a-IFN-β重組質粒按10倍比梯度稀釋，取8個梯度的（2.84×101～2.84×108copies·μL-1）的重組質粒作為陽性標準品進行qPCR檢測，計算Ct值并建立標準曲線。由圖4可見，Ct值與標準質粒濃度間呈現良好的線性關系，相關系數R2= 0.9951，鴨IFN-β標準曲線方程為y=-3.5444x+38.195，擴增效率E=92%（圖5），圖4為IFN-β的擴增曲線。

圖4 IFN-β 熒光定量RT-PCR擴增曲線Fig. 4 Amplification curve of qRT-PCR for IFN-β

圖5 IFN-β 熒光定量RT-PCR擴增的標準曲線Fig. 5 Standard curve of qRT-PCR for IFN-β

2.4 靈敏度檢驗

取含量為2.84×10-1～2.84×103copies·μL-1陽性標準重組質粒作為模板，每個樣品組內重復3次，進行qPCR檢測，各不同濃度樣品的Ct值（X±SD）見表2。所建立鴨IFN-β SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR方法可檢出下限為2.84 copies·μL-1，且在28.4 copies·μL-1以上的模板含量有良好的重復性。

表2 實時熒光定量RT-PCR敏感性檢測Table 2 Sensitivity of qRT-PCR assay

2.5 重復性檢驗

將所采集自雛鴨的肝、脾、胰3種不同組織樣品，以所建立的IFN-β 實時熒光定量RT-PCR檢測方法分別進行3次重復，進行組間及組內重復性檢測。結果顯示，3種不同組織樣品檢測的組內Ct值變異系數為0.11%～0.13%，組間Ct值變異系數均不超過1%（表3）。表明所建立的檢測方法重復性良好。

表3 實時熒光定量PCR方法的批內與批間重復性評價結果Table 3 Reproducibility of intra- and inter-qRT-PCR assays

3 討論與結論

宿主體內的多種細胞能夠分泌IFN-β，如淋巴細胞、成纖維細胞、內皮細胞等。當病毒感染后，宿主細胞分泌的IFN-β等干擾素并不直接殺傷或抑制病毒，而是與細胞表明的干擾素受體結合，通過JAKSTAT途徑激活下游多種干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些ISGs分泌的抗病毒蛋白發揮抗病毒、抗腫瘤和抗炎等免疫調節反應[11-12]。Li Ning等[13]發現鴨MAVS蛋白能夠激活鴨IFN-β表達，進而抑制感染早期時病毒的復制；Zhang Huihui等[14]、Li Ning等[15]發現宿主過表達鴨DDX1和DDX3X基因能夠激活鴨IFN-β等天然免疫信號通路，抑制病毒的復制；He Tianqiong等[16]發現鴨病毒性腸炎病毒的pUL47蛋白能夠抑制體內IFN-β及下游抗病毒蛋白的表達；DTMUV NS2A蛋白通過與duSTING結合，抑制鴨IFN-β轉錄，破壞STING介導的抗病毒天然免疫[17]。因此，IFN-β等Ⅰ型干擾素的轉錄水平是機體天然免疫的重要評價指標。

SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR技術無需設計探針、靈敏度高、操作方便，自動化程度高，減少了常規PCR的上樣電泳步驟，有效縮短了檢測時間，但對引物的設計要求較高。本研究設計的IFN-β引物，常規PCR擴增出現165 bp目的片段，熒光定量PCR擴增產物為單峰，均具有良好的特異性，適合用于建立鴨IFN-β SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法。

本研究構建了pET-30a-IFN-β重組質粒作為陽性標準品，通過繪制的標準曲線，y=-3.5444x+38.195，相關系數R2＞99.5%，表明線性擬合程度好，該方法靈敏度高，檢測下限為2.84 copies·μL-1，重復性良好，不同組織樣品的組內變異系數為0.11%～0.13%，組間變異系數不超過1%，可以直接用于樣品IFN-β mRNA表達量的準確定量檢測。本研究建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR檢測方法還可以利用GAPDH或β-Actin等管家基因作為內參，熒光定量PCR儀上同時進行IFN-β和管家基因的檢測，得到IFN-β mRNA表達水平的相對定量，明確IFN-β mRNA在不同組織和細胞中的表達差異，為從mRNA水平上研究鴨應答病原微生物感染的免疫調控機制奠定基礎。