龍眼DlAGOMEL1基因的克隆表達及亞細胞定位分析

陳榮珠，王小平，林美珍，賴鐘雄

（1. 漳州衛生職業學院藥學系，福建 漳州 363000；2. 福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】龍眼（Dimocarpus longanLour.）是無患子科龍眼屬的常綠喬木，主要分布于我國熱帶及亞熱帶地區，因其果肉富含營養物質及維生素，是藥食兩用的佳品，素有“北人參南桂圓”的美稱。龍眼胚胎發育的情況關系到其果核大小、坐果率、果實品質及產量，龍眼胚胎發育、果實品質和遺傳調控的研究是目前龍眼研究的熱點[1]。【前人研究進展】研究表明植物體胚發生過程中基因表達的時空特異性，不僅受特異的DNA序列調控，還受表觀遺傳調控，尤其是DNA甲基化修飾[2-4]。一定程度的DNA甲基化水平有利于植物體胚的正常發育，相對于非胚性愈傷組織，較低水平的DNA甲基化水平使胚性愈傷組織有更多的基因處于活躍轉錄狀態，從而保證植物胚胎發生能力的實現[5-6]。在水稻研究中發現AGO、DCL和RDR蛋白共同參與DNA甲基化，調控其體胚的發生[7]。其中Argonaute（AGO）蛋白是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的蛋白家族，其家族成員生物學功能多樣，如參與RNA誘導沉默途徑[8]，能與不同類型的小RNA結合并對對靶基因進行切割，在頂端分生組織干細胞的分化過程中具有維持作用，對病毒具有防御拮抗作用，參與DNA甲基化途徑[9-10]。擬南芥AGO5（AtAGO5）是水稻MEL1的同源基因，可能參與DNA甲基化和染色質修飾，被認為在配子發生過程中起作用[11]。水稻AGOMEL1能調節孢子體生殖細胞發育和減數分裂，MEL1功能缺失會導致水稻孢子母細胞在減數分裂早期發生異常，阻礙染色體凝聚，從而導致種子完全不育[12]。【本研究切入點】目前僅有少量關于AGOMEL1基因的功能研究，本課題組研究發現，龍眼AGO基因家族中DlAGO4、DlAGO6、DlAGO10在龍眼體胚不同發育階段中均有不同程度的表達[13-15]，但龍眼AGOMEL1的功能尚不清楚，該基因是否參與龍眼體胚發生過程的調控也未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究基于龍眼基因組數據庫，從中鑒定出龍眼基因組中AGO基因家族含有10個成員[16]，借助龍眼體胚發生系統，以龍眼DlAGOMEL1為目的基因，采用RT-PCR對其CDS及5′端上游啟動子序列進行克隆，對該基因的亞細胞定位進行研究，并明確其在龍眼體胚發生過程中的表達模式，為后續該基因的功能研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

龍眼紅核子品種體胚發生不同階段的材料：非胚性愈傷組織（NEC）、愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實結構（IcpEC）、球形胚（GE）和子葉形胚（EC）[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA、DNA提取及cDNA逆轉錄 采用Tripue（Transgen，China）試劑盒對其總RNA提取，提取完的RNA濃度用核酸微量檢測儀（Thermo Fisher，USA）檢 測。分 別 用SMARTer RACE 5′/3′Kit和YEASEN反轉錄試劑盒（Hifair? Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR）進行RT-PCR和qRTPCR逆轉錄。龍眼胚性愈傷組織的DNA提取采用傳統的CTAB法。

1.2.2 龍眼DlAGOMEL1基因CDS序列的獲取與驗證 從龍眼基因組數據庫提取DlAGOMEL1基因的CDS序列，用在線軟件Primer3.0設計特異性引物（表1），引物序列委托上海鉑尚生物技術有限公司合成。以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，進行該基因CDS序列的擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit（ThermoScientific，USA）回收目的片段。將回收產物連接轉化后并進行菌液PCR驗證，最后選擇陽性克隆子委托上海鉑尚生物技術有限公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 生物信息學分析 DlAGOMEL1蛋白的生物信息學分析包括信號肽、跨膜結構域、磷酸位點、糖基化位點、蛋白質保守結構域、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構、氨基酸多序列比對、分子系統進化樹、啟動子順式作用元件分析，具體分析方法及網站參照陳榮珠論文中的分析方法[18]。

1.2.4 實時熒光定量PCR 用DNAMAN6.0軟件設計特異性引物，以EIF-4a、EF-1a和Fe-SOD為內參基因，用Roche LightCycler 480進行qRT- PCR[19]。使用Excel、SPSS19.0和GraphPad Prism 5進行數據處理、分析和圖像繪制。

1.2.5 融合表達載體的構建及亞細胞定位分析 首先對DlAGOMEL1的CDS序列進行限制性內切酶分析，用primer 5設計上下游引物，進行帶有Eco31I酶切位點的PCR擴增。挑選陽性克隆子送鉑尚生物（上海）有限公司測序，提取質粒DNA。用Eco31I單酶切帶有酶切位點的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300載體，回收純化載體片段和目的基因片段。將酶切后的目的片段和載體片段連接過夜，轉T1大腸桿菌感受態，然后涂LB板（添加Kan）過夜培養，挑選陽性克隆子送測，擴繁菌液后進行重組質粒的提取，用Eco31I酶切pCAMBIA1300-DlAGOMEL1-35S-GFP進行酶切驗證。用凍融法將重組質粒及空載體轉化EHA105農桿菌，然后用農桿菌介導法注射侵染洋蔥內表皮并進行GFP熒光觀察。

2 結果與分析

2.1 龍眼DlAGOMEL1基因CDS和啟動子的克隆及融合表達載體的構建

以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，DlAGOMEL1-CF和DlAGOMEL1-CQ為上下游引物，進行DlAGOMEL1基因CDS的PCR擴增，電泳圖如圖1-A所示。將測序結果與基因組序列進行比對，序列完全一致，最后獲得該基因CDS序列全長為2655bp。以龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，以pro-AGOMEL1-F和pro-AGOMEL1-R為特異性引物，克隆獲得DlAGOMEL1基因5′端上游啟動子序列長度為1512bp（圖1-B）。

對克隆獲得的DlAGOMEL1CDS序列進行限制性內切酶分析，發現DlAGOMEL1未被Eco31I酶切割。利用Primer5.0軟件在酶切位點計上下游設計引物，克隆獲得帶酶切位點的產物，用Eco31I單酶切帶有酶切位點的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300，最后進行融合表達載體構建（圖1-C）并對融合表達載體進行酶切驗證。

圖1 龍眼DlAGOMEL1基因CDS和啟動子序列PCR擴增及融合表達載體的構建Fig. 1 Electrophoretograms of CDS of DlAGOMEL1 and promoter by PCR and fusion expression vector in longan

2.2 生物信息學分析

2.2.1 DlAGOMEL1蛋白的基本性質分析 信號肽預測結果顯示，DlAGOMEL1蛋白不含有信號肽，因此是一個非分泌蛋白。跨膜結構預測結果表明，DlAGOMEL1蛋白含有1個顯著的由內向外跨膜螺旋結構域，位于434～452 aa，長度為19個氨基酸，其值為821，因此，DlAGOMEL1蛋白的跨膜模型可能為N-末端向內向外。磷酸化和糖基化位點預測結果表明，DlAGOMEL1蛋白含有86個磷酸化位點（Ser:49，Thr:28，Tyr:9），4個糖基化位點。二級結構預測發現，DlAGOMEL1占比最多為無規則卷曲（44.12%），其次為α-螺旋（35.97%），β-折疊占比最少，僅為3.51%，并對該蛋白進行三級結構預測，結果與二級結構的預測結果一致（圖2）。利用SMART對DlAGOMEL1蛋白保守結構域進行分析，結果如圖3所示，該蛋白含有N-末端、DUF1785、PAZ、ArgoL2、Mid和Piwi保守結構域。

圖2 龍眼DlAGOMEL1蛋白三級結構預測Fig. 2 Predicted tertiary structure of DlAGOMEL1

圖3 龍眼DlAGOMEL1蛋白保守結構域預測Fig. 3 Predicted functional domains of DlAGOMEL1

2.2.2 龍眼DlAGOMEL1基因編碼蛋白的同源性分析 將龍眼AGOMEL1基因編碼的氨基酸序列提交NCBI-blastp比對，結果表明，龍眼AGOMEL1與以下9種植物具有較高的同源性，分別為漾濞槭（Acer yangbiense）、蜜柑（Citrus unshiu）、阿月渾子（Pistacia vera）、銀白楊（Populus alba）、克萊門柚（Citrus clementina）、胡 楊（Populus euphratica）、毛 果 楊（Populus trichocarpa）、甜橙（Citrus sinensis）、藍花耬斗菜（Aquilegia coerulea）。再利用DNAMAN 6.0軟件將龍眼等以上10種植物的AGOMEL1的氨基酸序列進行多序列比對，結果如圖4所示，顯示該基因在多種物種中高度保守。

圖4 AGOMEL1基因編碼氨基酸多序列比對Fig. 4 Multiple sequence alignment of AGOMEL1

2.2.3 系統進化樹分析 根據NCBI數據庫中胡楊、蘋果、甜橙、水稻、玉米等10多條AGOMEL1氨基酸序列，采用Mega5.05軟件的Neighbor-Joining構建核苷酸序列的分子系統進化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復1000 次）評估系統進化樹。結果如圖5所示，根據種屬進化樹的關系可知，龍眼DlAGOMEL1與雙子葉植物胡楊AGOMEL1的親緣關系最近，與單子葉玉米、水稻等AGOMEL1的親緣關系最遠。

圖5 AGOMEL1蛋白系統發育進化樹Fig. 5 Phylogenetic analysis on DIAGOMEL1 from longan and other plants

2.2.4 龍眼DlAGOMEL1基因的啟動子順式作用元件預測 將克隆獲得的DlAGOMEL1基因的啟動子序列提交至Plantcare在線預測網站進行順式作用元件預測，結果表明，該序列除了含有多個TATA-box和CAAT-box核心啟動子元件外，還含有響應脫落酸的ABRE元件、大量的光響應元件（Box 4、G-Box等）、高溫和低溫響應元件、與分生組織表達相關的CAT-box順式作用調控元件（表2）。

表2 龍眼AGOMEL1基因啟動子序列順式作用元件Table 2 Cis-acting elements of DlAGOMEL1 promoter

2.3 龍眼體胚發生過程中DlAGOMEL1基因的表達情況

為探究DlAGOMEL1基因在龍眼體胚發生的調控作用，利用實時熒光定量PCR儀檢測該基因在龍眼體胚發生不同階段的mRNA轉錄水平，結果如圖6所示。DlAGOMEL1基因在龍眼體胚發生不同時期的相對表達量變化較大，先下降后上升，呈“V”字型，非胚性愈傷組織階段（NEC）的相對表達量較高，隨著體胚的發育，其表達水平降低，到球形胚時期最低，接著又急劇上升，在子葉胚時期（CE）其相對表達量最高，呈顯著差異。相對表達量的顯著差異表明，DlAGOMEL1在龍眼體胚發生晚期階段可能發揮重要的調控作用。

圖6 龍眼體胚發生不同階段DlAGOMEL1的相對表達量Fig. 6 Relative expressions of DlAGOMEL1 at different somatic embryogenesis stages of longan

2.4 龍眼DlAGOMEL1基因的亞細胞定位分析

參照文獻[20]的方法對重組質粒pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP及pCAMBIA1300-35s-GFP進行農桿菌的轉化及篩選，然后將菌液注射到洋蔥內表皮，置于28 ℃的培養箱中暗培養3 d，以注射pCAMBIA1300-35s-GFP的洋蔥內表皮為對照，用熒光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號。結果顯示，轉入空載的洋蔥內表皮細胞，熒光分布于整個細胞，而加入DlAGOMEL1的重組載體轉入洋蔥內表皮細胞，熒光只分布于細胞質中，表明該基因定位于細胞質中（圖7-A～C），可能在細胞質中發揮功能作用（圖7-D～F）。

圖7 pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP蛋白在洋蔥內表皮細胞的亞細胞定位Fig. 7 Subcellular localization of pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP protein in onion

3 討論與結論

Argonaute（AGO）蛋白是一類RNA結合蛋白，在小RNA介導的基因沉默中起關鍵作用，該蛋白在真核生物中高度保守，主要含有典型的保守結構域，包括N-端、PAZ、Mid、Piwi[11]。目前，AGO蛋白家族在植物中的研究越來越多，而關于AGOMEL1的研究報道還較少，尤其未見在龍眼體胚中有報道。本研究以篩選鑒定出的龍眼AGO基因家族為基礎，克隆獲得了長度為2655 bp的DlAGOMEL1基因CDS全長序列，編碼884個氨基酸。同時，對該基因進行了生物信息學分析發現，DlAGOMEL1蛋白不存在信號肽，屬于非分泌蛋白，含有跨膜結構域，富含蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化修飾位點，推測該蛋白可能以蛋白磷酸化方式參與調控植物細胞的生長發育。龍眼AGOMEL1蛋白含有PAZ、Mid和Piwi 3個典型的保守結構域，PAZ結構域中含有β-桶亞結構域，該亞結構域可識別結合非特異單鏈核酸中3′端突出的2個堿基[21]；位于C端具有內切酶活性的Piwi結構域，能特異性地結合小RNA 5′-磷酸末端[11]，其含有一個保守的DDH/H motif催化三聯體中心，即D760、D845、H986和H798，因此具有切割活性，而分析發現AGOMEL1蛋白的Piwi結構域中H986缺失，為DD./H，推測該蛋白可能不具有切割活性。上述結果說明，DlAGOMEL1基因的生物學功能可能與其結構具有密切的關系。

AGO基因在植物的生長發育、抗逆脅迫、配子體形成和發育及DNA修復中發揮著重要的功能。水稻OsAGOMEL1能與5′末端為C的 21-nt siRNA結合，調控配子減數分裂前期的細胞分裂，但MEL1與siRNAs結合對生殖細胞發育的作用機制還需深入研究[14-15]；在雄配子體的形成、成熟與傳遞過程中，MET1、DRM2、ROS1、DME和DDM1表達并一直保持到營養核和精細胞分化的三核花粉期，導致染色質的修飾狀態改變[22]。但是，DlAGOMEL1在龍眼體胚發生過程的作用未見報道，本研究利用qRT-PCR檢測其相對表達情況，結果發現該基因在龍眼體胚發生過程中先下降后上升，且在子葉胚時期有最高的相對表達量，由此推測，DlAGOMEL1可能與龍眼體胚發生的晚期密切相關，但是該基因在龍眼體胚發生過程中的調控作用有待進一步深入研究。

探究蛋白質在細胞中的定位可進一步系統性地了解該基因的生物學功能[23]。GFP作為基因表達的常見報告因子，其具有易檢測、高靈敏度及熒光性質穩定[24]等特點，在越來越多的物種中被用于研究蛋白的亞細胞定位。關于不同物種AGOMEL1及其同源基因AGO5的亞細胞定位已有一些研究報道，番茄SlAGO5定位于核膜中[25]；水稻OsAGOMEL1主要定位于生殖細胞的細胞質中[11]，參與調控孢子體生殖細胞發育和減數分裂過程；在玉米中發現，AGOMEL1基因定位于細胞質中，參與小孢子期花粉的形成，在生殖細胞中破壞MEL1穩態導致phasiRNA靶基因脫靶分裂[14]；龍眼DlAGO5主要定位在細胞核[26]。本研究發現，龍眼DlAGOMEL1雖與DlAGO5在進化樹處于同一分支，但其定位于洋蔥內表皮細胞的細胞質中，該基因在龍眼中的生物學功能是否與單子葉植物水稻和玉米一樣參與調控減數分裂過程有待進一步研究。

本研究克隆獲得了龍眼DlAGOMEL1基因的CDS序列及5′端啟動子序列，并對其進行了生物信息學分析。結果表明，龍眼DlAGOMEL1蛋白含有保守結構域PAZ、Mid和Piwi，該蛋白含有大量的磷酸化位點及多個糖基化位點，與胡楊相似度最高。相對表達量分析結果表明，DlAGOMEL1在龍眼子葉胚時期可能發揮重要的調控作用。亞細胞定位表明，龍眼DlAGOMEL1基因定位于細胞質中。對該基因啟動子序列順式作用元件進行分析，結果表明，該序列含有多個脫落酸響應元件和大量光響應元件及溫度響應元件等，推測該基因的表達模式可能受外源激素、光及溫度等的影響。該研究結果為進一步探究AGOMEL1基因在龍眼體胚發生過程的作用提供了參考，也為龍眼分子育種提供了理論依據。