Hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4軸調控乳腺癌進展的研究

薛迪新 吳偉力 陳積賢 梁美珍 陳澄亮 賀新偉 余銘 林道浙

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率呈明顯上升趨勢。近年來，新的乳腺癌靶向藥物層出不窮，明顯改善了早期乳腺癌患者的預后，但是，局部晚期或者有轉移的乳腺癌患者預后仍然較差。目前乳腺癌侵襲和轉移的分子機制仍舊不明，尋找新的生物靶點對于改善乳腺癌患者的預后意義重大。miR-7是一種小分子miRNA，研究顯示其在乳腺癌中表達異常，可抑制乳腺癌干細胞發生轉移[1-2]；研究還發現另一類非編碼環狀RNA（circular RNA,circRNA）可調控miRNA的表達，進而參與腫瘤的侵襲和轉移[3]。為了尋找新的調控miR-7的circRNA，筆者利用starBase數據庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）進行檢索，結果顯示 hsa_circ_0001946與miR-7的結合位點最多，共有45個，因此，筆者預測hsa_circ_0001946可調控miR-7的表達。進一步檢索文獻發現，hsa_circ_0001946表達與非小細胞肺癌的侵襲和轉移有關[4]，而在乳腺癌中，hsa_circ_0001946表達與癌細胞侵襲和轉移的機制尚未被闡明。研究顯示腫瘤上皮細胞獲得侵襲和轉移能力往往伴隨著上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），還伴隨著E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達的變化[5]。因此，本研究探討hsa_circ_0001946表達與乳腺癌細胞侵襲和轉移的關系，并闡述癌細胞獲得侵襲和轉移的能力與EMT的關系，為乳腺癌治療提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 組織標本的收集 收集2018年6月至2019年8月在溫州醫科大學附屬第三醫院切除的乳腺癌組織標本及其癌旁正常乳腺組織標本91例，將標本用液氮速凍，保存在-80℃冰箱中。所有患者均為女性，術前均未進行放化療，乳腺癌分期根據2017年美國癌癥聯合委員會（AJCC）提出的第8版分期。其中乳腺導管原位癌9例，乳腺浸潤性導管癌82例。在乳腺浸潤性導管癌中，無淋巴結轉移41例，有淋巴結轉移41例（N1為22例，N2為8例，N3為11例）。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑和儀器 乳腺癌細胞株MCF-7（中國自北納生物公司）；RPMI1640細胞培養基（美國Gibco公司）；sh-hsa_circ_0001946及其陰性對照核苷酸、miR-7 mimics及其陰性對照寡核苷酸、Kruppel樣因子 4（Kruppel-like factor 4，KLF4）小干擾 RNA（small interfering RNA,siRNA）及其陰性對照核苷酸（中國上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（日本 TaKaRa公司）；Matrigel（美國BD Bioscience公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；E-cadherin及N-cadherin一抗（美國Abcam公司）；200倍顯微鏡（日本Olympus公司）；RT-PCR儀（德國Biometra公司）；7500實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 細胞轉染和分組 乳腺癌細胞株MCF-7接種于含10% FBS的RPMI1640培養基中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。采用Lipofectamine 2000進行細胞轉染，轉染前1 d將細胞接種至六孔板內，每孔1×106個細胞，轉染時細胞長至90%融合。分別將Lipofectamine 2000和核苷酸加入到250 μl OPTI-MEM培養基中稀釋，將稀釋液混合，輕輕混勻，室溫靜置20 min，轉染4～6 h后，細胞換液，轉染24 h后，收集細胞檢測miR-7、KLF4、E-cadherin、N-cadherin mRNA 表達及E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達。細胞分組：（1）轉染sh-hsa_circ_0001946組及陰性對照組：指轉染sh-hsa_circ_0001946的乳腺癌MCF-7細胞組及轉染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞分別采用實時熒光定量PCR法檢測miR-7、KLF4 mRNA表達水平及采用Transwell侵襲實驗檢測侵襲細胞數。（2）轉染miR-7 mimics組及其陰性對照組：指轉染miR-7 mimics的乳腺癌MCF-7細胞組及轉染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞采用實時熒光定量PCR法檢測KLF4 mRNA的表達水平。（3）轉染KLF4 siRNA組及其陰性對照組：指轉染KLF4 siRNA的乳腺癌MCF-7細胞組及轉染陰性對照核苷酸的乳腺癌MCF-7細胞組，此組細胞分別采用實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平。

1.4 hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法。總RNA提取采用TRIzol試劑，乳腺組織用液氮研磨，細胞直接用TRIzol試劑進行裂解，提取的總RNA保存在4℃冰箱供后續的逆轉錄及實時熒光定量PCR使用。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行逆轉錄，反應條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；實時熒光定量PCR采用SYBRPremix Ex TaqTMⅡ，20 μl體系參照說明書，反應條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60℃ 34 s，共40個循環，所有實驗重復 3次，以β-actin為內參。RT-PCR的引物如下：miR-7莖環引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACAAAAT-3'，正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGAAGACTAGTGAT-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；hsa_circ_0001946 正向引物：5'-GAAAATCCACATCTTCCAGACAA-3'，反 向 引物：5'-GAAGACATGGATATTGAGCCAGT-3'；KLF4 正向引物：5'-TTCCCATCTCAAGGCACACC-3'， 反 向 引 物 ：5'-CATGTGTAAGGCGAGGTGGT-3'；E-cadherin 正 向 引物：5'-CCTTCACAGCAGAACTAACA-3'，反向引物：5'-CGCTTTCAGATTTTCATCAA-3'；N-cadherin 正向引物：5'-ATTGGACCATCACTCGGCTTA-3'， 反 向 引 物：5'-CACACTGGCAAACCTTCACG-3'；β-actin 正向引物：5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算RNA的相對表達量。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。使用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠，撤血清讓細胞饑餓12 h，制備細胞懸濁液。取細胞懸液100 μl加入Transwell小室，24孔板下室加入500 μl含10%FBS的培養基，培養細胞24 h，取出Transwell小室，棄掉孔中培養液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醛固定30 min，將小室適當風干，在200倍顯微鏡下隨機選取3個視野對侵襲的細胞進行計數。

1.6 E-cadherin及N-cadherin蛋白表達水平檢測采用Western blot法。使用RIPA裂解液裂解細胞，收集完蛋白樣品后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質濃度測定，用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉染到PVDF膜上，轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉膜液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉 60 min。然后用 E-cadherin（1∶1 000）及N-cadherin（1∶3 000）一抗孵育，4 ℃過夜，加入洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min，吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5～10 min，共洗滌3次，二抗孵育，顯影，用膠片進行拍照。Western blot條帶的灰度值采用Image J軟件進行分析。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織比較采用配對t檢驗。采用Pearson相關分析乳腺癌組織中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中hsa_circ_0001 946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較 與癌旁正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中hsa_circ_0001946和KLF4 mRNA表達水平均升高，miR-7表達水平下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較

2.2 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946的表達與乳腺癌浸潤和轉移的關系 正常乳腺組織、乳腺導管原位癌組織、乳腺浸潤性導管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA 表達水平分別為 0.686±0.458、0.628±0.216、1.256±0.614。與正常乳腺組織、乳腺導管原位癌組織比較，乳腺浸潤性導管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（t=7.126和6.348，均P＜0.05）；而正常乳腺組織和乳腺導管原位癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較差異無統計學意義（t=0.668，P＞0.05），提示hsa_circ_0001946表達的升高與乳腺癌細胞的癌變無關，而與乳腺癌細胞發生浸潤有關，見圖1a。

進一步分析82例乳腺浸潤性導管癌患者，結果發現有淋巴結轉移者hsa_circ_0001946 mRNA表達水平為1.425±0.732，高于無淋巴結轉移者的1.087±0.411，差異有統計學意義（t=-2.575，P＜0.05），提示 hsa_circ_0001946表達升高與乳腺癌轉移有關，見圖1b。

圖1 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946的表達與乳腺癌浸潤和轉移的關系（a：正常乳腺組織、乳腺導管原位癌組織、乳腺浸潤性導管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較；b：有無淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA表達水平比較；*P＜0.05）

2.3 乳腺癌組織中 hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4 mRNA表達的相關性分析 Pearson相關顯示，乳腺癌組織中hsa_circ_0001946 mRNA的表達與miR-7的表達呈負相關（r=-0.418，P＜0.05），miR-7 的表達與 KLF4 mRNA mRNA 的表達呈負相關（r=-0.340，P＜0.05），提示在乳腺癌組織中，存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調控軸，見圖2。

圖2 乳腺癌組織中hsa_circ_0001946、miR-7、Kruppel樣因子4（KLF4）mRNA表達的散點圖（a：乳腺癌組織中hsa_circ_0001946與miR-7表達的散點圖；b：乳腺癌組織中miR-7與KLF4 mRNA表達的散點圖）

2.4 轉染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組中miR-7、KLF4 mRNA表達水平比較以及轉染miR-7 mimics組及其陰性對照組中KLF4 mRNA表達水平比較 轉染sh-hsa_circ_0001946組miR-7表達水平為2.119±0.135，高于陰性對照組的 0.675±0.139，差異有統計學意義（t=-22.351，P＜0.05）；而轉染 sh-hsa_circ_0001946組 KLF4 mRNA表達水平為 0.752±0.088，低于陰性對照組的1.694±0.141，差異有統計學意義（t=16.965，P＜0.05）。轉染 miR-7 mimics組 KLF4 mRNA表達水平為0.532±0.151，低于陰性對照組的1.619±0.138，差異有統計學意義（t=15.966，P＜0.05）。上述結果提示在乳腺癌細胞株MCF-7中，存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調控軸。

2.5 轉染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組侵襲細胞數比較 轉染sh-hsa_circ_0001946組侵襲細胞數為54.220±12.686，少于陰性對照組的153.986±16.733，差異有統計學意義（t=14.255，P＜0.05），表明在乳腺癌細胞中，通過抑制hsa_circ_0001946的表達，可抑制癌細胞發生侵襲，見圖3（插頁）。

圖3 轉染sh-hsa_circ_0001946組及其陰性對照組侵襲細胞數比較（a：轉染sh-hsa_circ_0001946組；b：陰性對照組）

2.6 轉染KLF4 siRNA組及其陰性對照組中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平比較 轉染KLF4 siRNA組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平均高于陰性對照組，N-cadherin mRNA和蛋白表達水平均低于陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），提示轉染KLF4 siRNA組中癌細胞的EMT受到抑制，見表2和圖4。

圖4 轉染Kruppel樣因子4（KLF4）小干擾RNA（siRNA）組及其陰性對照組中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）蛋白表達的電泳圖（a：E-cadherin；b：N-cadherin）

表2 轉染KLF4 siRNA組及其陰性對照組中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白表達水平

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，缺乏5'和3'末端，曾被認為沒有生物學功能。而近年來，越來越多的circRNA的生物學功能被發現，研究顯示，許多circRNA在腫瘤中出現異常表達[6-7]，并參與腫瘤的發生和發展，包括細胞的增殖、侵襲和轉移[8]。進一步研究顯示，circRNA是通過海綿作用，抑制miRNA的功能，進而調節癌基因或者抑癌基因的表達來發揮生物學效應。Liu等[9]研究顯示，乳腺癌細胞及組織中hsa_circ_001783表達升高，通過沉默hsa_circ_001783的表達，可抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，進一步研究發現hsa_circ_001783是通過海綿吸附miR-200c-3p來發揮作用的。

近年研究顯示，miR-7通過抑制ESAM的表達來抑制乳腺癌干細胞發生轉移[2]；研究還顯示許多circRNA可調控miR-7的表達，例如hsa_circRNA_0006528[10]、circ-TPGS2[11]、Circ-TFCP2L1[12]，那么，是否還存在其他circRNA來調控miR-7的表達呢？為了尋找新的具有調控miR-7的circRNA，筆者利用starBase數據庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）進行檢索，結果顯示，在5大miRNA靶基因預測數據庫中（targetScan、picTar、RNA22、PITA、miRanda） 共有 784 條 circRNA，其中hsa_circ_0001946與miR-7的結合位點最多，共有45個可供結合的位點，表明hsa_circ_0001946與miR-7具有很高的結合效率，更為有效地調控miR-7的表達。因此筆者預測hsa_circ_0001946的靶點為miR-7。

miR-7是一種非編碼小RNA，可負性調控靶基因的表達，來抑制腫瘤的侵襲和轉移。Zhu等[13]研究顯示miR-7-5p可通過負性調控METTL7B靶基因，來抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和侵襲。Zheng等[14]研究顯示miR-7-5p可通過抑制靶基因OGT的表達，來抑制結直腸癌癌細胞的侵襲和轉移。Huang等[15]研究顯示KLF4是miR-7的靶基因，miR-7通過負性調控KLF4的表達來調控食管鱗狀細胞癌的侵襲和轉移。同樣，Dong等[16]在大腸癌中的研究也顯示KLF4是miR-7的靶基因。而在乳腺癌細胞中，研究顯示miR-7表達下降[1]，KLF4表達升高[17]，提示在乳腺癌細胞中，KLF4也可能是miR-7的靶基因，進一步檢索相關文獻發現，在乳腺癌干細胞中miR-7表達下降，通過負性調節靶基因KLF4，導致癌基因 KLF4表達升高，促進癌細胞向顱腦轉移[18]。

眾所周知，干細胞在乳腺癌組織中比例極低，上述提到miR-7在干細胞中表達下降使其具有轉移潛能，而在乳腺癌組織中占絕大比例的普通癌細胞中，其miR-7表達下降，是否也可通過上調KLF4的表達，促進癌細胞的侵襲和轉移呢？因此，本研究提出如下假設：在普通乳腺癌細胞中存在一條新的調控軸，即hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4，上述的調控軸可調節乳腺癌細胞發生侵襲和轉移。

本研究顯示在91例乳腺癌組織中，hsa_circ_0001946表達升高，miR-7表達下降，KLF4 mRNA表達升高。本研究還顯示hsa_circ_0001946在乳腺浸潤性導管癌中表達明顯高于乳腺正常組織，提示hsa_circ_0001946表達的升高可促進乳腺癌發生侵襲。本研究還發現在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中hsa_circ_0001946表達明顯高于無淋巴結轉移的乳腺癌組織，提示hsa_circ_0001946表達升高可促進乳腺癌發生轉移。進一步研究發現，在乳腺癌組織中miR-7的表達與hsa_circ_0001946、KLF4的表達均呈負相關，上述結果提示在乳腺癌組織中存在hsa_circ_00019 46/miR-7/KLF4調控軸，調控著乳腺癌細胞的侵襲和轉移。

本研究繼續在細胞水平驗證hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4的調控關系，通過轉染實驗發現在乳腺癌細胞株MCF-7中存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調控軸。為了進一步驗證hsa_circ_0001946表達與乳腺癌細胞侵襲的關系，本研究采用Transwell侵襲實驗，通過抑制hsa_circ_0001946的表達，可抑制癌細胞發生侵襲，因此，在乳腺癌細胞水平中也存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4的調控軸，此調控軸與癌細胞的侵襲有關。

KLF4是一種轉錄因子，有研究認為KLF4具有抑癌基因的功能[19]。在胃癌細胞中，KLF4的表達可促進胃癌細胞發生EMT，促進癌細胞發生轉移[20]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，KLF4表達也與腫瘤的EMT有關[21]。EMT指上皮細胞失去細胞之間的連接，獲得間葉細胞的表型及侵襲、轉移的能力，EMT期間伴隨著上皮細胞標志物E-cadherin和細胞角化蛋白表達的下降，間葉細胞標志物波形蛋白和N-cadherin表達的升高[5]，本研究探討在乳腺癌細胞中KLF4的表達與EMT的關系，結果顯示，與陰性對照組相比，轉染KLF4 siRNA組MCF-7細胞中E-cadherin mRNA及蛋白表達水平均升高，而N-cadherin mRNA及蛋白表達水平均下降，提示KLF4的表達可促進乳腺癌細胞發生EMT，從而引起乳腺癌細胞發生侵襲和轉移。

綜上所述，在乳腺癌細胞中存在hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4調控軸，激活上述調控軸，可使癌細胞中hsa_circ_0001946表達升高，使癌細胞發生EMT，進而促進乳腺癌細胞發生侵襲和轉移。