miRNA在哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液細胞中的表達和作用研究

劉敏 唐蘭芳

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現為可逆性氣流阻塞、支氣管高反應性和慢性炎癥，在世界范圍內具有較高的發病率和死亡率[1-2]。目前已知哮喘是由環境因素和遺傳因素間相互作用所引起的，但其發病機制尚未完全闡明。近年來越來越多的證據表明，表觀遺傳調控在哮喘發病中起重要作用[3-4]。

miRNA是一組進化上高度保守的長度約19～22個核苷酸的單鏈非編碼 RNA。每個miRNA通過沉默靶mRNA來調節數百個編碼和非編碼基因。目前已有部分miRNA被報道可能通過調節細胞增殖、分化及黏膜纖毛功能受損等參與哮喘的發病機制[2，5]，但研究標本大多來自動物哮喘模型、成人肺組織或者哮喘兒童血清等。由于哮喘兒童肺組織難以獲得，而支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）是反映肺組織的最佳標志物。本研究利用miRNA芯片分析哮喘兒童BALF細胞中miRNA水平，通過qRT-PCR對差異表達的miRNA進行驗證，并對可能的靶基因的表達水平進行檢測，從而探討miRNA參與兒童哮喘發病中可能的作用機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2017年2月在浙江大學醫學院附屬兒童醫院呼吸內科住院的哮喘患兒15例為哮喘組，哮喘診斷標準參照2016年中華醫學會兒科學分會呼吸學組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]。所有患兒均接受過糖皮質激素治療，近期無好轉或病情進展，排除其他肺部疾病、免疫疾病及心血管系統疾病或BALF不合格患兒。選取同期本院確診為支氣管異物的12例患兒為對照組，異物均在24 h內經纖維支氣管鏡取出，排除右肺中葉異物、其他肺部疾病、免疫疾病、心血管系統疾病及過敏性疾病或BALF不合格患兒。因樣本數量限制，取哮喘組5例、對照組4例患兒的BALF細胞用于miRNA芯片檢測；再取哮喘組5例、對照組3例患兒的BALF細胞用于驗證miR-34/449家族；最后取哮喘組和對照組各5例患兒的BALF細胞用于驗證miR-200家族和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因。E-cadherin蛋白表達水平測定所用標本為以上用于驗證miR-34/449家族和miR-200家族表達的所有患兒BALF細胞的上清液。兩組患兒在不同檢測過程中性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本實驗獲得所有患兒家長或監護人的同意，并經本院醫學倫理委員會審批通過（浙兒倫申2015-HP-037）。

表1 不同檢測組患兒性別及年齡的比較

1.2 BALF收集 首先選定灌洗部位為右肺段中葉，所有患兒行纖維支氣管鏡操作前15～30 min靜脈注射馬來酸咪達唑侖（0.3 mg/kg）進行全身麻醉，達到適當的麻醉深度后，纖維支氣管鏡經鼻腔或口腔輕柔進入，到達聲門前及氣管處分別通過細硅膠管滴注2%利多卡因進行局部麻醉，進入至右肺中葉后，快速注入37℃0.9%氯化鈉溶液進行肺泡灌洗（每次1 ml/kg，單次最大量為20 ml，共3次），結束后以25～100 mmHg（-3.3～-13.3 kPa）負壓吸引回收，裝入塑料容器內。標本均在4℃，300 g條件下離心10 min，分別收集BALF細胞、上清液用于進一步研究，其中細胞用于RNA提取，上清液用于ELISA蛋白檢測。BALF合格標準為：（1）達到規定的回收量，即回收量大于總灌注量的40%；（2）紅細胞數不超過灌洗液細胞總數的10%；（3）上皮細胞數應小于灌洗液細胞總數的3%。經檢測入組對象的BALF均符合標準。

1.3 miRNA芯片檢測 使用QIAGEN RNeasy微量試劑盒（德國凱杰公司）從BALF細胞中提取總RNA，使用AffymetrixGeneChip miRNA 4.0陣列（美國昂飛公司）對miRNA進行檢測。使用FlashTagBiotin HSR RNA標記試劑盒（美國昂飛公司），通過Poly(A)聚合酶標記來自細胞的1 μg總RNA。按照使用建議，將 RNA與 AffymetrixGeneChip miRNA 4.0陣列雜交。使用GeneChip2雜交、洗滌和染色試劑盒（美國昂飛公司）和 GeneChip2 Scanner 3000 7G進行染色、洗滌和掃描。使用 Affymetrix Command Console軟件進行特征提取。原始數據按以下順序處理：背景檢測、RMA全局背景相關性、分位數歸一化、中值估計和使用 miRNA QC軟件工具（美國昂飛公司）進行 log2轉換。

1.4 差異表達miRNA的驗證及靶基因的表達測定 采用qRT-PCR法檢測miRNA芯片檢測到的miR-34/449家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA的表達，以驗證是否與基因芯片結果一致，同時用以檢測靶基因E-cadherin的表達。用Trizol試劑（美國英杰生命技術有限公司）提取總RNA。使用NanoDrop Lite分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測量 RNA濃度。miRNA qRT-PCR使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Ki（t廣州銳博生物科技有限公司）。對于目標基因E-cadherin的表達，使用GoScriptTM Reverse Transcription System獲得 cDNA，通過GoTaqqPCR Master Mix試劑盒（美國普洛麥格公司）對目標基因表達進行驗證。數據使用2-ΔΔCt法進行分析。U6和GAPDH分別作為miRNA和E-cadherin表達的內參。miRNA的反向引物序列及內參U6引物序列均由銳博公司設計并合成，所有引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5 目標基因分析和驗證 通過miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/）、miRTarBase數據庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）和查閱文獻等選取miRNA-34/449和miRNA-200家族的靶基因E-cadherin，通過上述qRT-PCR法檢測E-cadherin基因的表達水平。使用BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）測量 BALF上清液中的總蛋白量，使用人E-cadherin Quantikine ELISA試劑盒（美國R&D生物有限公司）測量E-cadherin的蛋白水平，其中E-cadherin蛋白與總蛋白的比值（E-cadherin/總蛋白蛋白比值）用于估計E-cadherin蛋白表達水平。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件和Graph-Pad Prism 6.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒中存在差異性表達的miRNA比較 兩組患兒存在65個差異表達的miRNA（圖1，見插頁）。哮喘組有22個miRNA比對照組增加了2倍或更多，顯著上調的 miRNA為 miR-143-3p、miR-424-3p、miR-199a-3p 和 miR-199b-3p，分別增加了 3.71、3.58、3.46 和3.46倍；其他上調的miRNA包括miR-3197、miR-4484、miR-503-5p、miR-1290、miR-1304-5p、miR-6126、miR-212-3p、miR-7515、miR-3135b、miR-6780b-5p、miR-4430、miR-6772-5p、miR-4417、miR-4485、miR-204-3p、miR-4533、miR-1183 和 miR-6758-5p，見表3。另外，哮喘組有43個miRNA呈低表達水平。miR-34/449家族的3個miRNA，包括 miR-34b-5p、miR-34b-3p和miR-34c-5p均顯著下調，僅為對照組的0.07、0.08和0.09倍。其他下調的miRNA包括miR-34/449家族的其他成員（如 miR-34c-3p、miR-449a）、miR-200 家族（miR-200a/b/c、miR-429 和 miR-141）、miR-23b/27b簇（miR-23b、miR-27b）、miR-92b、miR-100等。6個miR-34/449 家族的 miRNA（miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p、miR-449a和 miR-449b-5p）和 7 個miR-200 家族的 miRNA（miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-429和miR-141-3p）減少，占哮喘兒童BALF細胞下調miRNA的 30.2%（13/43），見表 4。

表3 BALF細胞中22個表達上調的miRNA

表4 BALF細胞中43個表達下調的miRNA

圖1 兩組患兒中存在的65個差異表達的miRNA

2.2 差異表達miRNA驗證 由于miR-34/449家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA占所有下調miRNA的很大比例，因此本研究選取了這兩個miRNA家族進行驗證。miR-34/449家族驗證顯示哮喘組患兒 miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p表達水平均低于對照組（均P＜0.05），而兩組患兒miR-449a和miR-449b-5p表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖2。miR-200家族驗證顯示哮喘組患兒miR-200a-5p、miR-200a-3p、miR-200b-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p 和 miR-141-3p表達水平低于對照組（P＜0.05），而兩組患兒miR-429比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 miR-34/449家族驗證結果（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖3 miR-200家族驗證結果（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 兩組患兒E-cadherin基因及蛋白表達水平比較 哮喘組患兒E-cadherin基因表達水平低于對照組（P＜0.05）。哮喘組患兒E-cadherin/總蛋白蛋白比值為（0.001 6±0.000 4）%，低于對照組的（0.003 5±0.000 7）%，差異有統計學意義（P＜0.05），提示哮喘組患兒E-cadherin蛋白表達水平低于對照組，見圖4。

圖4 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）驗證結果（*P＜0.05）

3 討論

哮喘是一種復雜的異質性疾病，以炎癥細胞（嗜酸性粒細胞、Th、巨噬細胞等）、活化結構細胞（支氣管上皮細胞、氣道平滑肌細胞）為主要效應細胞，參與哮喘中的免疫應答及氣道重塑。越來越多的研究表明，miRNA可通過調控炎癥細胞、氣道上皮或成纖維細胞的比例和功能變化在哮喘的發病中發揮重要作用[7-9]。但是對于miRNA與兒童哮喘關系的研究大多通過血液、痰液或者哮喘動物模型來實現，直接通過患兒BALF來進行的研究較少。因此相較于血液、痰液等，BALF檢測miRNA可以更準確、直接地反映兒童哮喘肺部病理變化。

本研究發現在哮喘組與對照組患兒間存在miRNA的差異表達，提示miRNA參與了哮喘的發病機制，而差異表達的miRNA與之前的報道略有不同[10-11]，可能與樣本來源、疾病階段或嚴重程度有關，因此需要進一步研究這些差異表達miRNA的細胞來源、特定表達機制和實際功能。盡管哮喘組中存在22個上調miRNA，且miR-143-3p在哮喘組呈高表達水平，但筆者發現哮喘中呈低表達miRNA約占總體的2/3（43/65），因此推測哮喘中miRNA大多為表達下調。

已知一個miRNA家族中的miRNA通常具有相似的miRNA序列，可能調控相似基因并發揮相似的作用。本研究發現miR-34家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA在哮喘兒童中表達下調，并通過qRT-PCR驗證了miR-34/449家族的4個miRNA和miR-200家族的6個在哮喘兒童中呈低表達水平。已知轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受體介導的信號通路可通過調節氣道慢性炎癥、氣道高反應性及氣道重塑等過程，在哮喘中發揮重要作用[12-13]。基于腫瘤研究指出，miR-34/449家族和miR-200家族可與TGF-β形成復雜的反饋環，包括SNAIL 同源物 1（snail homolog 1,SNAI1）/miR-34雙重負反饋環和鋅指E-盒結合同源異形盒（zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB）/miR-200雙重負反饋環，且SNAI1和ZEB1/2的表達對E-cadherin均表現為抑制作用[14]。本研究通過生物信息數據庫預測E-cadherin是兩個家族的靶基因，并在基因和蛋白表達水平進行驗證，發現哮喘患兒E-cadherin表達下降。E-cadherin是維持上皮完整性和通過釋放生長因子和促炎因子介導氣道上皮免疫功能的重要黏附分子，其丟失和重新分布可能促進上皮細胞的炎癥活動，在哮喘的發病機制中起重要作用[15]。因此miR-34家族和miR-200家族可能通過調控E-cadherin的表達參與哮喘的發病機制，為哮喘的防治提供新靶點。此外根據相關文獻，預測兩種miRNA家族參與哮喘的信號通路可能為TGF-β受體介導的信號通路。

本研究存在以下局限：首先，對照組實際上并不是正常的兒童，雖然本研究選擇了24 h內去除異物的患兒，但BALF細胞可能與正常兒童的BALF細胞存在一些差異。其次，由于樣本量較少，BALF中的細胞有限，用于miRNA芯片、qRT-PCR和 ELISA的樣本來自不同的患兒，并不是一一對應。最后，miRNA與靶基因之間的關系沒有通過進一步的實驗（基因敲除、免疫組化等實驗）來驗證。因此對于哮喘中具體的miRNA調控機制的認識需要更進一步、更深入的研究來明確。