富血小板血漿對肩袖損傷后脂肪浸潤干預作用的研究

趙晨 胡勁濤 張瓊 賁定嚴

肩袖損傷是引起肩關節持續疼痛的主要原因，在所有人群中發生率為5%～33%，而在年齡＞60歲人群中發生率高達25%[1]。盡管有相當多的患者肩袖損傷無臨床表現，但其中部分患者會逐漸出現癥狀。肩袖損傷后會出現相關肌肉的萎縮、纖維化和脂肪浸潤等病理改變，這些肌肉中成脂指標[CCAAT增強子結合蛋白 β（CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ）]表達水平增高，并且伴有脂肪浸潤的肩袖損傷患者在手術修復后肩關節功能恢復較差，且更容易出現肩袖再撕裂[2-3]。有研究發現即使修復肩袖仍不能阻止脂肪浸潤的進展，因此有效控制和治療肩袖損傷后脂肪浸潤將有利于提高肩袖手術修復的臨床療效[4]。富血小板血漿（plateletrich plasma,PRP）是血液離心后獲得的血小板和各種生長因子的濃縮物，具有促進組織修復的能力[5-6]。本研究擬探討PRP對肩袖損傷模型大鼠脂肪浸潤的干預作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，體重200～230 g，購自上海西普爾實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2018-0006，在溫度（22±2）℃、濕度40%～60%、晝夜各12 h的環境中適應性飼養1周后進行實驗。本研究經浙江省人民醫院動物倫理委員會審批通過。

1.2 試劑 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin,mTOR）、C/EBPβ、PPARγ抗體（英國Abcam公司）。SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒（美國MCE公司）、TRIzol試劑（美國Life Technologies公司）、RIPA裂解液（美侖生物科技有限公司）。

1.3 分組及造模 將30只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、PRP組，每組10只。3組大鼠均右側肩關節造模，左側為健側。假手術組僅予以切開皮膚，暴露肩袖組織后縫合，于岡上肌多部位肌肉內注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，每2 d注射1次；模型組和PRP組暴露肩袖后予以切斷岡上肌肌腱，然后縫合皮膚。模型組于岡上肌多部位肌肉內注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，每2 d注射1次；PRP組于岡上肌多部位肌肉內注射PRP 0.5 ml，每2 d注射1次。3組大鼠均干預4周。

1.4 標本收集及指標檢測 所有大鼠均在造模8周后采用CO2窒息方式處死，以尖刀片分離獲取岡上肌。

1.4.1 肌肉濕重比 將新鮮獲取的健側及造模側岡上肌進行稱重，肌肉濕重比=造模側肌肉濕重/健側肌肉濕重×100%。

1.4.2 造模側岡上肌病理組織學觀察 將岡上肌組織固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋后制作成2 μm厚切片，采用油紅O染色觀察岡上肌組織中脂肪形成情況。隨機選取岡上肌中腹部5個區域，采用Image J軟件計算每個區域內20根肌纖維的橫截面積，取其平均值。

1.4.3 造模側岡上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。取100 mg造模側岡上肌剪碎后，加入10倍體積的TRIzol裂解液，于勻漿機充分勻漿裂解后提取總RNA，應用反轉錄試劑盒將 RNA反轉錄為cDNA。使用PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）引物進行 qRT-PCR 檢測，配置 10 μl反應體系[5 μl SYBR Master mix（2×）、0.2 μl 10 μM 上游引物、0.2 μl 10 μM下游引物、1 μl cDNA、3.6 μl ddH2O]，按熱啟動（95 ℃5～10 min）、變形（95 ℃ 15 s）和退火延伸（60 ℃ 30 s）40個循環、延伸（95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s）1個循環，以2-ΔΔCt法計算目標基因表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4 造模側岡上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取100 mg造模側岡上肌剪碎后，加入岡上肌組織10倍體積的RIPA裂解液，于勻漿機充分勻漿裂解后提取總蛋白，測定蛋白濃度后進行電泳轉膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，去除封閉液加入1:1 000比例稀釋的一抗（PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、GAPDH），于 4 ℃搖床下孵育過夜，第2天去除一抗后進行二抗孵育，完成后加入ECL顯影液在Tanon-5200全自動化學發光圖像分析系統進行顯影。

1.5 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠岡上肌肌肉濕重比比較 造模8周后，模型組、PRP組、假手術組大鼠岡上肌肌肉濕重比分別為（67.93±6.70）%、（84.03±3.45）%、（97.47±2.90）%。模型組大鼠岡上肌肌肉濕重比小于假手術組和PRP組（均P＜0.01），PRP組大鼠岡上肌肌肉濕重比大于假手術組（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠岡上肌病理切片脂肪浸潤情況和肌纖維橫截面積比較 模型組大鼠岡上肌中脂滴形成較假手術組明顯增多，且肌肉組織出現萎縮；PRP組岡上肌中脂滴形成數量較模型組明顯減少，且肌肉組織萎縮程度也較輕，見圖1（插頁）。模型組、PRP組、假手術組大鼠肌纖維橫截面積分別為（1 064.33±76.81）、（1 767.33±85.05）、（2 118.00±266.28）cm2。模型組大鼠肌纖維橫截面積小于假手術組和PRP組（均P＜0.01），PRP組肌纖維橫截面積大于假手術組（P＜0.01）。

圖1 3組大鼠岡上肌組織病理檢查所見[a：假手術組；b：模型組；c：富血小板血漿（PRP）組；油紅O染色，×100]

2.3 3組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達水平比較 模型組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達水平均高于假手術組（均P＜0.05），提示肩袖損傷后岡上肌中脂肪分化水平升高；而PRP組大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達水平均低于模型組（均P＜0.05），表明PRP可以起到抑制肩袖損傷后肩袖肌肉組織脂肪分化的作用，見圖2和表2。

2.4 3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平比較 模型組大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平均高于假手術組（均P＜0.05），提示肩袖損傷后岡上肌中PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活；而PRP組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平均低于模型組（均 P＜0.05），PI3K、Akt、mTOR mRNA 及蛋白表達的趨勢與成脂指標一致，提示PRP可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而抑制肩袖損傷后肩袖肌肉組織中脂肪分化，見圖3和表3～4。

表3 3組大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA表達水平比較

圖3 3組大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）mRNA及蛋白表達水平比較（a：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達水平比較；b：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的電泳圖；c：3組大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平比較；PRP為富血小板血漿；*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

肩袖損傷后相應肌肉的脂肪浸潤是肩袖肌肉組織中出現異位脂肪的形成，盡管大量研究者們對肩袖損傷后脂肪浸潤的相關機制進行了探索，但其具體的作用機制仍未被闡明。目前認為年齡、肌肉損傷、機械失負荷、激素失衡等是引起肌肉組織中異位脂肪形成的重要原因，肌肉組織中的多能干細胞或前體細胞在脂肪形成信號通路激活后向脂肪細胞分化是其潛在的分子機制[7-8]。

表4 3組大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平比較

RP是自體血在離心后獲得的血小板濃縮血漿，血小板是由巨核細胞釋放的無核細胞碎片，包含各種生長因子、細胞因子、ATP、鈣離子、5-羥色胺、多巴胺等多種物質，對維持組織穩態具有重要作用，在臨床上PRP已被廣泛應用于治療各種軟組織疾患[9-10]。Fitzpatrick等[11]應用PRP治療慢性臀肌腱病，結果顯示PRP能明顯減輕患者的疼痛癥狀，改善臀部肌肉功能。一項關于PRP治療肩袖相關疾病的Meta分析表明，PRP能提高患者短期和長期的肩關節功能，而且還可以減少肩袖損傷修復后再撕裂的發生[12]。PRP對組織穩態的維持和修復能力很可能與其能夠調節相關細胞的分化，從而維持組織完整結構有關。Liao等[13]應用不同濃度的PRP干預脂肪干細胞，發現PRP能夠顯著促進脂肪干細胞的增殖能力，同時抑制了脂肪干細胞向成脂的分化。另一項研究觀察了不同PRP濃度對間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化的影響，結果顯示PRP血小板濃度＞1 500×109pl/L可以顯著增加MSCs的增殖，低血小板濃度僅有輕微促進MSCs成脂分化的作用，而在血小板濃度＞1 800×109pl/L時促進成脂分化的作用顯著，血小板濃度在（200～3 000）×109pl/L可以促進MSCs向成骨分化，（1 000～3 000）×109pl/L能夠促進MSCs向成軟骨分化[14]。因此，PRP很可能通過調節肩袖肌肉組織中細胞的分化起到預防肩袖損傷后脂肪浸潤發生的作用。本研究應用PRP干預肩袖損傷模型大鼠的岡上肌，發現PRP治療后大鼠岡上肌中脂滴的形成明顯減少，模型組中反映脂肪形成指標的C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達水平均高于假手術組，而PRP干預過的岡上肌中C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表達水平相比模型組有明顯下降，這表明PRP能夠有效阻止肩袖損傷后脂肪浸潤的發生。Takase等[15]的研究結果與本研究結果相似，他們同時進行了體內和體外研究，體外研究顯示PRP促進了C2C12細胞（小鼠成肌細胞）的增殖，而抑制了其成脂分化潛能；體內研究顯示PRP明顯減少了肩袖肌肉組織中脂滴的形成，組織內成脂相關基因被抑制。

PI3K/Akt/mTOR信號通路作為細胞內重要的信號通路之一，通過調節下游相關靶蛋白的活化狀態，調控細胞的增殖、分化及蛋白質合成，其在脂肪形成過程中具有重要意義[16-17]。Joshi等[18]發現PI3K/Akt/mTOR信號通路可以通過調控轉錄因子PPAR調節肩袖組織內脂肪浸潤的發生，而PPAR和C/EBPβ參與了MSCs分化為脂肪前期細胞的過程。本研究結果發現肩袖損傷模型大鼠岡上肌中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平較假手術組升高，這表明肩袖損傷會激活肩袖肌肉組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而促進肩袖肌肉組織內脂肪的形成；而在PRP干預后，PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平較模型組明顯降低，岡上肌中脂肪的形成也相應減少，這表明PRP能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，減少肩袖肌肉組織內脂肪分化。

綜上所述，本研究結果表明PRP能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，減少肩袖損傷后脂肪浸潤的發生。