基于SSR標記構建廣西杉木核心種質*

李魁鵬，陳仕昌，程 琳，賀錦鋒，唐紅亮，譚文婧，余代淵，王 斌，莫宗恒，黃開勇**

(1.廣西壯族自治區林業科學研究院,廣西優良用材林資源培育重點實驗室,廣西南寧 530002；2.融水苗族自治縣國營貝江河林場，廣西柳州 545300；3.融安縣西山林場， 廣西柳州 545400)

0 引言

種質資源是動植物遺傳改良的物質基礎，在品種選育以及優異材料創制和利用研究中起重要作用。由于盲目開發及生態環境問題，導致物種多樣性銳減，種質資源受到世界各國的關注，并相繼創建了種質資源庫[1]，保存收集各類種質資源。隨著收集數量增多，保存管護、評價利用方面出現各種困難，且種質資源未能充分發揮其重要作用，故核心種質的概念及其構建的方法得以提出和發展[2,3],其思想是通過合理的方法，從原始種質中篩選代表性的材料構成核心種質，其數量規模遠小于原始種質，意在提高種質資源利用效率，發掘優異基因。

我國核心種質研究工作起步于1994年，最先在部分農作物上建立核心種質[4-8]，在林木中的有關研究工作相對滯后。目前白樺Betulaplatyphylla[9]、柿Diospyroskaki[10]、灰楸Catalpafargesii[11]、歐洲黑楊Populusnigra[12]、尾葉桉Eucalyptusurophylla[13]、日本柳杉Cryptomeriajaponica[14]、銀杏Ginkgobiloba[15]、木荷Schimasuperba[16]和水青樹Tetracentronsinense[17]等樹種構建了核心種質。多年生林木樹體高大，占地面積廣，需耗費大量經費管護，建立核心種質可更高效地保護和利用林木種質資源。

杉木Cunninghamialanceolata是我國南方重要的針葉用材樹種之一，具速生、材質優等特點，在國家木材儲備戰略中具有重要地位[18]。廣西從20世紀70年代開始進行杉木遺傳改良工作，持續收集了不同產區的杉木種質材料，為杉木遺傳改良提供了豐富的種質資源[19,20]。隨著杉木種質資源收集數量增多，保存與評價利用的難度加劇，因此構建核心種質對充分利用現有杉木種質資源，挖掘優異基因顯得尤為重要。本研究通過SSR分子標記技術檢測國家杉木良種基地基因庫的864份種質材料的遺傳多樣性，對比分析不同構建方法的差異，從而確定合適的構建方法和取樣比例，為廣西杉木種質研究和挖掘優異基因提供理論支撐與材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自廣西融安縣西山林場(25°20′ N，109°23′ E)和融水苗族自治縣國營貝江河林場(24°57′ N，109°11′ E)國家級杉木良種基地基因庫。杉木種質取樣總數為864份，其地理來源分別為廣西(605份)、湖南(70份)、廣東(55份)、福建(54份)、江西(40份)、貴州(31份)和湖北(9份)。

2019年11月，采集健康且無病害的杉木新鮮嫩葉，放入1.5 mL離心管后，投入液氮罐暫存，帶回實驗室后于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 主要儀器及試劑

22對SSR引物[21]由北京睿博興科公司合成，植物DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，NanoDrop-2000型超微量分光光度計購自美國熱電公司，ABI 3730xl型基因測序儀購自美國ABI公司，Biometra Tone 96G PCR儀購自德國EasyCycler公司。主要試劑有氯仿、β巰基乙醇、異丙醇、50×TAE等。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴增——SSR標記法

杉木種質樣本基因組DNA提取按照植物DNA提取試劑盒提供的方法進行。 (1)用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA，15-20 min)檢測DNA純度和完整度。用紫外觀測儀觀察電泳結果，若DNA分離較好，亮度較好，沒有彌散，說明提取的DNA純度較高且比較完整；若DNA沒有分離，亮度較差且存在彌散，則需要重新提取DNA。(2)用NanoDrop-2000超微量分光光度計測定提取的DNA樣品濃度。合格標準A260/A280值為1.70-1.90，若不處于此范圍則重新提取DNA。提取結果合格的各樣品DNA模板(共864份)，用TE Buffer統一稀釋至15 ng/μL后，于-20 ℃冰箱保存備用。

PCR擴增反應在Biometra Tone 96G PCR儀上進行，反應體系為10 μL：5 μL 2×Taq plus Mix，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，DNA模板2 μL，去離子水加至10 μL。擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s (40 個循環)；72 ℃ 10 min，4℃保存。PCR擴增產物在美國ABI 3730xl基因測序儀上檢測，利用GeneMarker V2.2.0軟件讀取每個位點的片段大小。

1.4 遺傳參數分析

采用GenAlEx 6.502軟件[22]統計分析22對SSR引物的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和Shannon′s信息指數(I)等5個遺傳多樣性指標，利用Cervus 3.0.7[23]分析SSR引物的多態信息含量指數(PIC)及無效等位基因頻率(Fna)。

1.5 核心種質構建方法

按照杉木種質的地理來源進行分組，將864份材料分為廣西、湖南、廣東、福建、江西、貴州和湖北等7組，根據Core Finder軟件[24](簡稱MC法)、Power Core軟件[25](簡稱MP法)、模擬退火算法(Simulated annealing algorithm)[26]以等位基因數最大化標準(簡稱SANA法)和模擬退火算法以遺傳多樣性最大化(Maximizing genetic diversity)標準(簡稱SAGD法)分別構建核心種質:

(1)按照等位基因數最大化(Maximizing allelic richness)標準(M策略)，運用MC法和MP法對原始種質進行分析并抽取核心種質，取樣比例由軟件自動設定。

(2)根據SANA法，運用Power Marker v3.25軟件構建核心種質，取樣比例設置為10%、15%、20%、25%和30%。

(3)根據SAGD法，運用Power Marker v3.25軟件構建核心種質，取樣比例設置為10%、15%、20%、25%和30%。

1.6 數據分析與處理

核心種質構建完成后，利用SPSS 22.0對4種方法構建的核心種質庫與原始種質庫的相關遺傳參數進行有效性t檢驗，利用主坐標分析法(Principal Coordinates Analysis,PCoA)生成核心種質、原始種質的分布圖，進一步確認核心種質的代表性。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果及遺傳多樣性分析

對864份杉木種質的遺傳多樣性進行檢測，結果見表1。22個SSR標記的片段大小為96-295 bp。864份材料中：(1)檢測到195個等位基因(Na)，平均每對引物檢測出8.86個等位基因，其中等位基因數最多的引物是SSR12(15)、SSR16(15)，其次是SSR8(14)，最少的是SSR2(5)、SSR13(5)；(2)有效等位基因數(Ne)最多的是SSR8(6.01)，其次是SSR12(5.01)，最少的是SSR21(1.46)，平均為3.13;(3)在觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和Shannon′s信息指數(I)方面，最高的是SSR8，最低的是SSR21，平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均Shannon′s信息指數值分別為0.62,0.65和1.31;(4) 22對SSR引物的多態信息含量指數(PIC)值為0.30-0.82，平均值為0.60，最高的是SSR8，最低的是SSR21，其中中度多態性引物(0.250.5)有18對;(5)22對SSR引物的無效等位基因頻率(Fna)均小于0.2，均值為0.03，說明22對SSR引物對遺傳多樣性參數分析沒有影響，結果準確可靠。

表1 廣西杉木種質資源的遺傳多樣性分析

2.2 4種構建方法的遺傳多樣性差異分析

對4種方法構建的杉木核心種質情況進行遺傳多樣性分析，結果見表2。4種構建方法的等位基因數(Na)保留率均在75%以上，其中：(1)在等位基因數(Na)方面，MC法和MP法構建的核心種質Na保留比例達100%；SANA法取樣比例為10%時，Na保留率最低(丟失了48個等位基因，僅保留147個);(2)在有效等位基因數(Ne)方面，SAGD法和SANA法的核心種質Ne隨取樣比例增大呈先降低后升高的趨勢，最高的是MP法，其次是MC法，最少的是取樣比例為25%的SAGD法；MP法、MC法和SAGD(25%)法Ne保留率分別為108.7%、107.6%和99.4%;(3)在Shannon′s信息指數(I)方面，MP法、MC法的核心種質高于原始種質，而取樣比例為10%-30%的SANA法和SAGD法，其Shannon′s信息指數值隨取樣比例增加而升高，均能夠保留原始種質97.7%的Shannon′s信息指數值，與原始種質相差不大;(4)在觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)方面，4種構建方法的核心種質保留率均在98.4%以上。SANA法、SAGD法5個取樣比例構建的核心種質的等位基因數與原始種質的等位基因數存在顯著差異，未能保留所有的等位基因，最高的是取樣比例為30%的SANA法和SAGD法(僅保留了174個等位基因，丟失了21個)，在抽取的種質數量上比MC法多了179份，但保留的等位基因數沒有MC法的多。結合5個遺傳多樣性指標的保留率及種質數量進行綜合考慮，可認為MC法、MP法構建的結果較好。

表2 不同方法構建核心種質的遺傳多樣性比較

2.3 核心種質的確認

為了驗證核心種質的有效性，利用SPSS 22.0分別對MC法、MP法構建的核心種質與原始種質、核心種質與保留種質的5個遺傳多樣性參數(Na、Ne、I、Ho和He)進行t檢驗，結果見表3。結果表明：(1)MC法構建的核心種質Na、Ne、I、Ho和He的保留率分別為100%、107.6%、106.9%、100%、103.1%；在等位基因數(Na)和有效等位基因數(Ne) 2個指標上顯著高于MC法的保留種質，但與原始種質沒有顯著差異;(2)MP法構建的核心種質Na、Ne、I、Ho和He的保留率分別為100%、108.7%、107.6%、100%、104.6%；在等位基因數(Na)和有效等位基因(Ne)2個指標上均顯著高于Mp法的保留種質，與原始種質沒有差異；說明MC法、MP法對原始種質的冗余材料進行了剔除，有效地選擇含等位基因多的材料。

表3 遺傳多樣性參數t檢驗

將MC法和MP法構建的核心種質進行檢驗比較，結果表明，兩者在Na、Ne、I、Ho和He上沒有差異。相較于MP法，MC法僅保留80份種質材料就能保留原始種質的所有等位基因，其遺傳重復和冗余度小于MP法，因此最終選擇遺傳重復低、冗余度低的MC法篩選的80份材料作為廣西杉木核心種質。在這80份核心種質中，地理來源為廣西的種質最多，有54份(占8.9%)，最少的是湖北(2份，占22.2%)(表4)。利用主坐標分析法展示原始種質與核心種質的分布情況，對MC法核心種質作進一步確認(圖1)，結果顯示,核心種質與原始種質均分布在主坐標內且范圍相近，說明MC法構建的核心種質的代表性較好。

表4 不同地理來源杉木種質入選MC法核心種質的數量及比例

圖1 MC法核心種質的主坐標分析

3 討論

目前，構建核心種質主要應用表型數據和分子標記數據[27]。多年生林木容易受到環境因素影響，采用傳統調查方法得到的表型數據(樹高、胸徑、葉形、果實大小等)往往不能準確地反映材料間的遺傳差異，且數據收集需持續多年觀測調查，整個過程耗費巨大的人力和物力[28,29]。相較于傳統表型數據，DNA分子標記技術具有費用低、數據獲取速度快和不受外界因素影響的特點，能夠真實地反映材料間差異及親緣關系，比表型數據更適用于構建核心種質和遺傳多樣性分析，被廣泛應用于各類種質資源研究[30-34]。

合理的取樣比例是成功構建核心種質的決定因素。國內外研究報道中，大多數取樣比例為5%-40%[4,8,35-37]。吳昊等[38]利用苗期生長量及種子質量性狀的表型數據構建了野生榧樹Torreyagrandis種群的初級核心種質，取樣比例為36%，并利用分子標記檢測初級核心種質，剔除了部分遺傳重復的材料，最終保留了15份材料，占原始種質的10.56%；鐘永達等[39]基于幼苗及種子的表型數據，用4種不同聚類方法從872份材料中構建了含218份種質材料的中國樟樹Cinnamomumcamphora初級核心種質，取樣比例為25%；彭嬋等[40]報道了含45份南方型美洲黑楊Populusdeltoides的初級核心種質，占原始種質的15%。這些研究結果表明，取樣比例隨原始種質材料的數量增多而降低。一般來說，由于物種的獨特性，其取樣比例主要由樹種、遺傳結構、遺傳多樣性及種質數量規模決定。本研究中共有864份杉木種質材料，將不同取樣比例的結果進行對比分析，其中SANA法和SAGD法的等位基因數隨著取樣比例增加而增加，但均未能保留原始種質的全部基因，說明這2種方法在構建核心種質時并未能篩選出等位基因數多的材料，存在遺傳重復的材料，構建效果較差。而MC法構建結果的取樣比例最低(占原始種質的9.3%，篩選出80份種質材料)，取樣比例低于前人的研究結果[41-43]，但在等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon′s信息指數(I)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的保留率上均達到100%，可見Mc法能用較少的種質保留原始種質所有等位基因數，保留效果較好。

不同構建方法直接影響核心種質的代表性和有效性。在進行核心種質構建時，應遵循優先選擇特異基因和等位基因數目多的材料，以及盡可能保留含多等位基因的原則，以保證獲得的核心種質具有最多的等位基因[44，45]。M策略是以每個位點的等位基因數目最大化為標準，主要通過Core Finder[24]、Power Core[25]和Power Mstrat[46]這3款軟件實現，在構建過程中能夠剔除材料中的遺傳重復，篩選出具等位基因數目多且冗余度低的材料，是目前最具優勢的構建方法之一。本研究的MC法、MP法、SANA法是以等位基因數最大化為標準，能夠篩選出具等位基因多的材料，而SAGD法是以遺傳多樣性最大化為標準，篩選出的材料具有較大遺傳多樣性。結果發現，SANA法和SAGD法構建結果不佳，而Core Finder軟件和Power Core軟件構建結果的Na、Ne、I、Ho、He等5個遺傳參數的保留率高于SANA法和SAGD法，說明MC法和MP法優于SAGD法和SANA法。在選擇核心種質材料時，MC法、MP法均選擇等位基因數目多且冗余度低的材料，相比而言，Core Finder軟件的構建結果比Power Core軟件的少了18份，僅用80份核心種質保留了864份原始種質中的全部等位基因，其構成的核心種質庫更為精簡，遺傳重復和冗余度更低。

廣西是全國杉木主產區之一，1976年和1979年，廣西區內29個種源參加全國杉木產區的種源試驗，廣西融水種源在兩次試驗中表現突出，其因適應范圍廣，單株材積大、樹高和胸徑生長量高且穩定，被認定為全國杉木優良種源之一。廣西屬典型的喀斯特地貌，地形復雜多變，山地丘陵居多，北回歸線橫穿境內，南北溫差大，各地種源在生長量和適應性方面存在差異，具較強的地域性。受喀斯特地理隔離影響，廣西境內還有一些特異的種質資源，如念水糠杉、白云糠杉和四榮紅心杉等[20,47,48]。融江河流域位于全國優良種源南嶺的西部，是廣西杉木的中心產區[49-51]。本研究廣西的605份材料中，主要由融水(262份)、融安(152份)、河池(75份)、桂林(36份)、玉林(34份)、百色(19份)、梧州(13份)、南寧(7份)和欽州(7份)等9個不同市縣的種質構成。入選的80份核心種質中，有54份材料來自廣西，其中廣西杉木中心產區來自融水縣(20份)、融安縣(15份)的種質材料居多，其余的分別來自河池(7份)、百色(5份)、桂林(3份)、梧州(2份)、玉林(2份)和欽州(1份)，本次入選的種質材料基本涵蓋了整個廣西杉木分布區。未入選核心種質的材料仍不能隨意舍棄，當核心種質遭受自然災害發生衰亡或無當前生產實踐所需的高產優質和抗逆性強的重要性狀時，可從保留種質中尋找相似材料進行補充[24]。隨著核心種質的深入研究，需要及時對核心種質遺傳結構和材料進行調整與更新，不斷增補新發現的特異材料，使其具有更豐富的遺傳變異，更合理的遺傳結構。

本研究利用SSR分子標記數據，通過對比分析不同構建方法的差異，從而確定以等位基因數最大化為標準(M策略)、通過Core Finder軟件構建廣西杉木核心種質的構建方法。由于缺少生長量、抗逆性等表型數據以及SSR分子標記數量的限制，并沒有將表型數據和分子數據結合起來構建，今后的研究中仍需收集調查表型生長性狀，將兩者相結合起來，對核心種質作進一步全面分析和調整。

4 結論

本研究基于SSR分子標記技術，以廣西杉木864份種質為材料，通過構建方法篩選，最終確定M策略(Core Finder軟件)構建方法，并構建了含80份材料的廣西杉木核心種質，其中，種質數占原始種質的9.3%，Na、Ne、I、Ho和He遺傳多樣性參數的保留率達100%，經主坐標分析和t檢驗，驗證所構建的核心種質與原始種質差異不顯著，分布范圍與原始種質基本一致，說明構建結果有效且具較好的代表性，可為廣西杉木種質資源優異基因資源挖掘、創新利用提供理論依據與材料基礎。