小麥乙烯響應轉錄因子基因 wfzp突變體穎果發(fā)育的研究

冉莉萍，夏敏潔，姚慧慧，余徐潤，陳 剛，熊 飛

(1.揚州大學廣陵學院，江蘇揚州 225000； 2.江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心/揚州大學教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)場品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇揚州 225009)

小麥穎果由果皮、胚、胚乳三大部分組成，它們的發(fā)育彼此不同卻又密切關聯(lián)，共同影響穎果的發(fā)育[1]。胚乳為穎果的主要部分，占穎果總重量的85%以上，其主要成分是淀粉和蛋白質，分別積累在淀粉體和蛋白體中，淀粉體和蛋白質的發(fā)育狀況直接影響小麥的產(chǎn)量和品質[2]。Brown等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥穎果的發(fā)育過程中，胚乳細胞呈現(xiàn)數(shù)目增加、細胞體積增大以及淀粉體和蛋白質體充實等現(xiàn)象。

小麥葉片光合作用制造的光合產(chǎn)物由莖進入小穂軸，最后由母體養(yǎng)分運輸組織(包括果皮維管束、合點、珠心突起傳遞細胞)和子代養(yǎng)分運輸組織(包括傳遞細胞、胚乳輸導細胞和糊粉層)運輸至胚乳中[1]。研究表明，隨著穎果的發(fā)育和胚乳的灌漿充實，維管束附近的珠被和部分珠心組織分化形成合點-珠心突起-珠心突起傳遞細胞；而胚乳表層細胞則分化為糊粉層、糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞[4]。王慧慧等[5]和王 兵等[4]利用光鏡和透射電鏡觀察相結合，系統(tǒng)地追蹤了穎果發(fā)育過程中養(yǎng)分運輸組織的結構變化；Radchuk等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Jekyll基因編碼的一種特殊蛋白在珠心突起細胞的形態(tài)建成過程中起決定性的作用；Yu等[7]也證實了糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞具有吸收和運輸養(yǎng)分的功能。

乙烯響應因子(ERF)是植物中特有的一類轉錄因子，是AP2/ERF超家族中的1個亞族，其內部含有1個AP2結構域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AP2/ERF家族成員參與糧食作物的生長發(fā)育過程。如OsERF基因與水稻胚乳糊粉層中特異表達的轉錄因子OsNF-YB1發(fā)生互作，對調控籽粒灌漿和胚乳發(fā)育有重要作用[8]；OsEATB基因能夠降低成熟期水稻的株高和穂長，增加小穂的分枝數(shù)，從而提高糧食產(chǎn)量[9]；OsAP2基因的過表達能夠提高水稻的籽粒填充率和籽粒產(chǎn)量[10]；轉錄因子OsEBP-89和RSR1對胚乳細胞中淀粉的含量、結構、淀粉顆粒形態(tài)等特性有重要作用[11-12]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，ERF類轉錄因子ZmEREB94調控玉米籽粒淀粉合成相關基因的表達。Liu等[14]和高 天等[15]分別發(fā)現(xiàn)，AP2/ERF家族中的成員TaRSR1和TaERF1a基因與灌漿期小麥籽粒淀粉的合成密切相關，其表達水平高低會直接影響淀粉的含量。

小麥WFZP基因編碼的是一類ERF，該基因的功能缺失會引起小麥幼穂護潁原基與外稃原基之間產(chǎn)生側生組織原基，并進一步發(fā)育成側小穂，從而提高穂粒數(shù)[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小麥WFZP基因突變后可以直接或間接地調控花序分生組織的活性和小穗數(shù)；同時汪 瑩等[23]還發(fā)現(xiàn)WFZP基因通過影響TaGW5和TaGW8等基因的表達來調控細胞分裂，從而影響粒寬。小麥穂的發(fā)育與穂小花數(shù)、籽粒結實率、同化物分配、碳水化合物的代謝等密切相關[18]。目前，小麥WFZP基因已被克隆，其在小麥穗發(fā)育調控中的重要功能已得到解析，然而關于WFZP基因突變后對小麥穎果發(fā)育影響的報道很少。因此，本研究利用EMS誘變的小麥wfzp基因突變體為材料，系統(tǒng)分析該突變體小麥穎果發(fā)育過程中形態(tài)結構的變化，以期深入了解WFZP基因在小麥穎果發(fā)育中的功能，為小麥EMS誘變育種提供了形態(tài)學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的兩個突變體材料由煙臺吉恩生物科技有限公司提供，為栽培小麥品種濟麥22 EMS誘變后選出的株系，經(jīng)M5代篩選鑒定獲得的穩(wěn)定遺傳純合突變系。其中，純合突變體1是2B染色體103196377位點的C堿基突變?yōu)門堿基(命名為wfzp1)，純合突變體2是2A染色體66849157位點的C堿基突變?yōu)門堿基(命名為wfzp2)。野生型小麥品種濟麥22為本試驗對照株系。小麥于2019-2020年度種植在江蘇省作物栽培生理重點實驗室的試驗田中，小麥生長期間進行常規(guī)管理，保證肥水充足，于開花期采用記號筆點穎與植株掛牌相結合的方法正確標記開花日期。

1.2 穎果鮮干重、可溶性糖和總淀粉含量的測定

采集花后7、10、12、15、20和25 d的穎果,測定鮮重后，將其置于鼓風干燥箱中，105 ℃殺青 1 h，在42 ℃下烘干至恒重(干重) 。

選取成熟小麥籽粒，于105 ℃殺青2 h后， 70 ℃烘干。將烘干樣品研磨成粉，過100目金屬網(wǎng)篩，稱取200 mg粉末，采用蒽酮比色法測定可溶性糖和總淀粉含量[19]。

1.3 穎果的顯微結構觀察

參考Yu等[7]的方法，取不同發(fā)育時期的小麥穎果，從中部切斷，迅速置入2.5%戊二醛溶液前固定12 h。用磷酸緩沖液(PBS，pH=7.2)清洗三次，每次10 min。清洗后的樣品經(jīng)20%、40%、60%、80%、90%和100%的乙醇梯度脫水(每次30 min，100%乙醇脫水三次)、環(huán)氧丙烷置換、Spurr樹脂浸透與包埋。包埋好的樣品置于70 ℃烘箱中聚合12 h，然后將聚合好的樣品用超薄樹脂切片機(徠卡,德國)切1 μm厚的切片，用0.5%甲基紫染色10 min后在光學顯微鏡下拍照，圖像采集后進行數(shù)據(jù)分析。每個材料選取3個穎果作為重復,每個穎果來自不同麥穗。

1.4 胚乳中充實物質數(shù)量特征統(tǒng)計

參照Yu等[7]的方法,利用Photoshop CS6軟件與Image-Pro Plus軟件相結合，統(tǒng)計分析胚乳細胞中淀粉體和蛋白體的相對面積。每個樣品統(tǒng)計3粒穎果作為重復,每粒穎果拍攝3張顯微圖片用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，同時對不同樣品間測量值的差異在0.05 水平上進行顯著性檢驗(LSD 法)。

2 結果與分析

2.1 WFZP基因突變后穎果及果皮的生長發(fā)育特征

由圖1可以看出，小麥穎果表面的顏色隨著穎果發(fā)育呈現(xiàn)出白色-綠色-黃綠色的變化。花后7～12 d穎果形態(tài)變化較大，不斷縱向膨脹生長，果皮發(fā)育早期呈乳白色。發(fā)育至花后15 d左右時，穎果縱向生長基本恒定，然后橫向生長，果皮顏色由白變綠。花后20～25 d，穎果基本成型，無明顯形態(tài)變化，果皮顏色逐漸由綠色變?yōu)辄S綠色。與濟麥22相比，在相同的發(fā)育階段，wfzp1和wfzp2突變體穎果果皮顏色較深。這說明小麥WFZP基因突變體的穎果生長速度快，使得穎果發(fā)育期縮短，提前成熟。

wfzp1和 wfzp2：突變體；JM22：濟麥22(野生型)。下同。標尺=5 mm。

由表1可以看出，隨著穎果發(fā)育，wfzp1和wfzp2突變體和濟麥22的鮮重均呈上升趨勢，干重和含水量均呈先上升后下降的變化趨勢。wfzp1和wfzp2突變體穎果鮮重、干重在各個發(fā)育時期均顯著高于濟麥22(除花后7 d，wfzp1突變體與濟麥22無顯著差異外)，而含水率則低于濟麥22，在花后7、12和25 d，差異均達到顯著水平(表1)。wfzp1和wfzp2突變體成熟籽粒中總淀粉含量和可溶性糖含量也存在差異，其中總淀粉含量分別為77.82%和81.34%，含量均高于濟麥22(76.06%)，且wfzp2突變體與濟麥22差異顯著；三者的可溶性糖含量間無顯著差異，這說明WFZP基因在穎果發(fā)育過程中參與胚乳儲藏物質(尤其是淀粉)的積累。

表1 花后不同天數(shù)小麥穎果鮮重、干重及含水率的變化

2.2 WFZP基因突變后穎果果皮的發(fā)育特征

WFZP基因突變后，在小麥穎果果皮發(fā)育過程中，淀粉積累與降解、果皮細胞凋亡以及橫細胞形態(tài)等方面均發(fā)生了明顯變化(圖2)。

外果皮位于果皮的最外層，起保護作用。花后7 d，濟麥22外果皮細胞中積累著大量的淀粉體(圖2C1)；花后10～12 d，淀粉體逐漸降解，數(shù)量減少(圖2F1和I1)。與濟麥22相比，穎果發(fā)育早期，wfzp1突變體外果皮細胞有少量淀粉體(圖2A1、D1和G1)，而wfzp2突變體外果皮細胞中幾乎沒有淀粉體(圖2B1、E1和H1)。花后 15～25 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體外果皮細胞內的淀粉體幾乎降解，并出現(xiàn)加厚的細胞壁(圖2J1～R1)。

中果皮是果皮的主要組成部分，淀粉體主要在中果皮細胞中積累。從圖2中可以看出，wfzp1和wfzp2突變體中果皮中淀粉粒積累量少、果皮細胞尺寸小、中果皮細胞凋亡進程快(圖2A2～R2)。花后7 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體中果皮細胞中積累大量的淀粉體，并且在中果皮和內果皮的空隙間還存在大量游離分布的淀粉體(圖2A2～C2)。花后10～12 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體小麥穎果中果皮細胞均開始凋亡，并出現(xiàn)凋亡空腔，細胞中的淀粉體開始降解，數(shù)量減少(圖2D2～I2)，其中濟麥22中果皮細胞中淀粉體尺寸大，有大量未降解的淀粉體充斥在細胞凋亡的空腔中(圖2F2和I2)，而wfzp1和wfzp2突變體中果皮凋亡空腔中剩余的淀粉體明顯較少(圖2D2、E2、G2和H2)。花后15 d，wfzp1和wfzp2突變體中果皮細胞基本完全降解，僅在濟麥22中存在未降解的淀粉體，分布在橫細胞以及外果皮和橫細胞的空隙間(L2)。這說明WFZP基因突變會加快小麥穎果中果皮細胞的凋亡速度及其細胞中淀粉體的降解速度。花后20 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體中果皮細胞完全消失，僅存在凋亡空腔，在空腔和內果皮之間還有少量未降解的淀粉體(圖2M2～O2)。花后25 d，中果皮淀粉體逐漸完全降解(圖2P2～R2)。

SG：淀粉體；EP：外果皮；ME：中果皮；TC：管細胞；CC：橫細胞。圖左側顯示的均為花后天數(shù)。標尺=20 μm。圖3和圖5同。

內果皮由橫細胞和管細胞兩部分構成，分別由果皮內部的上皮細胞及靠近上皮細胞的單層細胞發(fā)育而來[7]。從圖2可以看出，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體內果皮的橫細胞會隨著穎果的發(fā)育變成瘦長形，形狀比較規(guī)則，細胞質顏色逐漸變淡(圖2A3～R3)。花后7～12 d，wfzp1突變體內果皮中的管細胞隨著穎果的發(fā)育逐漸消失(圖2A3、D3和G3)；與wfzp1突變體相比，濟麥22內果皮中的管細胞消失速度較慢，花后25 d還沒有完全消失(圖2C3、F3、I3、L3、O3和R3)；而wfzp2突變體內果皮中的管細胞不會消失，一直存在(圖2B3、E3、H3、K3、N3和Q3)。以上觀察結果說明，WFZP基因在2B染色體上的突變能夠在小麥穎果發(fā)育早期促進內果皮細胞的發(fā)育，使wfzp1突變內果皮管細胞降解速度較快；而在2A染色體上的突變則會抑制內果皮細胞的發(fā)育，使wfzp2突變體內果皮管細胞發(fā)育緩慢，這說明不同染色體上WFZP基因位點的突變對小麥穎果果皮發(fā)育的影響存在明顯差異。

2.3 WFZP基因突變后穎果胚乳的發(fā)育規(guī)律

小麥胚乳的發(fā)育過程主要包括胚乳細胞的分裂、生長以及胚乳細胞中淀粉體和蛋白體的充實。從圖3可以看到，花后7 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體內、外胚乳細胞開始分化，細胞核明顯，且細胞中已經(jīng)積累了少量的小淀粉體(圖3A1～C1、A2～C2)。花后10～12 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體細胞開始生長分化，此時，內、外胚乳細胞中淀粉體積累量增多，體積變大，且大多聚集在細胞壁周圍，其中wfzp1和wfzp2突變體細胞中開始積累蛋白體(圖3D1、D2、E1、E2、G1、G2、H1和H2)，而濟麥22內、外胚乳細胞中尚未積累蛋白體(圖3F1、F2、I1和I2)。胚乳細胞中淀粉體和蛋白體相對面積統(tǒng)計結果表明，wfzp1和wfzp2突變體胚乳的蛋白體比濟麥22出現(xiàn)時間早，且花后7～12 d，淀粉體和蛋白體相對面積都明顯高于濟麥22(圖4)。花后15 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體蛋白體和淀粉體的積累量變多(圖3J1～L1、J2～L2)，此時wfzp1突變體的內胚乳淀粉體相對面積明顯大于wfzp2突變體，但兩個突變體胚乳中的總蛋白體和總淀粉體相對面積仍明顯大于濟麥22，且wfzp2突變體大于wfzp1突變體(圖4)，這說明胚乳細胞中淀粉的積累受WFZP基因影響較大。花后20 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體蛋白體互相靠近，融合形成大的蛋白體，且細胞中胚乳淀粉進一步充實，同時還分化出了一些小淀粉體(圖3M1～O1、 M2～O2)；此時， 濟麥22內胚乳細胞中蛋白體相對面積超過wfzp2突變體，但在總蛋白體相對面積上無明顯變化(圖4)。花后25 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體淀粉體之間相互擠壓變形，蛋白體體積增大，相互聚集，充實在淀粉體間隙，使胚乳結構變得更加致密(圖3P1～R1、P2～R2)，此時，除wfzp1和wfzp2突變體內胚乳蛋白體相對面積小于濟麥22外，兩個突變體胚乳中的蛋白體和淀粉體的相對面積均明顯大于濟麥22(圖4)，這說明WFZP基因突變體胚乳細胞貯藏物質積累量多，胚乳細胞充實度高。

SG：淀粉體；PB：蛋白體。

圖4 wfzp突變體內、外層胚乳細胞中蛋白體和淀粉體相對面積的變化

2.4 WFZP基因突變后穎果糊粉層傳遞細胞與胚乳傳遞細胞的發(fā)育過程

在小麥胚乳灌漿充實期，養(yǎng)分經(jīng)珠心突起傳遞細胞傳遞至穎果中的胚乳腔中，然后通過子代養(yǎng)分運輸組織(糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞)運輸至胚乳。糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞是由胚乳腔最外面的1～2層胚乳表皮細胞分化而來，它們?yōu)榕呷橹袃Σ匚镔|的充實提供了結構基礎[4]。從圖5可以看出，花后7 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體胚乳腔的胚乳表層細胞進入細胞分裂期，有明顯的細胞核和濃稠的細胞質(圖5A1～C1、A2～C2)。花后10 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞的細胞壁出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，wfzp1和wfzp2突變體糊粉層傳遞細胞的部分部位出現(xiàn)壁內突(圖5D1、E1)，胚乳傳遞細胞中也積累了較多的淀粉體(圖5D2、E2)；與兩個突變體材料相比，濟麥22糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞的發(fā)育明顯較慢，糊粉層細胞未出現(xiàn)壁內突，胚乳傳遞細胞中的淀粉體也較少(圖5F1、F2)。花后12～25 d，濟麥22、wfzp1和wfzp2突變體糊粉層傳遞細胞的細胞壁進一步加厚，細胞壁內突清晰可見；胚乳傳遞細胞的體積變大，胞內積累的淀粉體數(shù)量多且體積大(圖5G1～R1、G2～R2)。從子代傳遞細胞發(fā)育程度來看，wfzp1和wfzp2突變體傳遞細胞壁內突的細胞數(shù)量和厚度均高于濟麥22，同時胚乳傳遞細胞中淀粉體積累也較多。以上結果表明，wfzp1和wfzp2突變體穎果中糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞的發(fā)育狀況好于濟麥22，有利于穎果中胚乳貯藏物質的充實。因此，綜合以上結果可以發(fā)現(xiàn)，WFZP基因突變的小麥品種具有較高發(fā)育程度的子代養(yǎng)分運輸組織，更有利于灌漿期營養(yǎng)物質向胚乳中輸送和穎果營養(yǎng)物質的積累，這可能是wfzp1和wfzp2突變體灌漿快、胚乳充實程度高的重要原因之一。

ATC：糊粉層傳遞細胞；ETC：胚乳傳遞細胞；TW：加厚的細胞壁；SG：淀粉體。

3 討 論

AP2/ERF是植物所特有的最大轉錄因子家族之一，因其在基因育種等方面有重要作用而倍受關注。目前，已在多種植物中開展了對AP2/ERF轉錄因子家族成員的鑒定和功能研究[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，AP2/ERF家族轉錄因子參與植物種子發(fā)育的過程[22]。汪 瑩等[23]指出，編碼AP2/ERF的基因突變后可直接或間接調控果實成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，在穎果發(fā)育早期，與野生型濟麥22相比，wfzp1和wfzp2突變體穎果果皮顏色較深，穎果果皮細胞中的淀粉積累量比野生型高，果皮細胞凋亡速度也比野生型快。這說明在小麥穎果發(fā)育過程中，wfzp基因突變能夠加速穎果成熟，導致穎果灌漿時間縮短。本研究還發(fā)現(xiàn)，花后 20 d以后，wfzp2突變體果皮發(fā)育進程受到了一定程度的抑制，而wfzp1突變體則無明顯變化，這說明wfzp基因不同位點的突變所帶來的表型不同。在前人的研究中也有類似的報道結果，如Liu等[24]深入挖掘了大量番茄品種的RNA測序數(shù)據(jù)指出，在番茄成熟的過程中，ERF轉錄因子突變后其表達模式不同，進而使其功能發(fā)生改變。

胚乳是小麥穎果儲藏物質積累的重要部位，其發(fā)育過程主要包括胚乳細胞數(shù)目的增加、細胞體積的擴大、淀粉體和蛋白質體的充實等。Jofuku等[20]研究發(fā)現(xiàn)，AP2基因的缺失導致種子的尺寸、重量、蛋白質總含量和含油量均顯著升高。也有研究認為，該基因突變后通過調控種皮細胞的延伸來控制種子大小，同時種子中己糖與蔗糖含量的比例也發(fā)生了改變[25]。AP2/ERF 家族的成員RSR1負調控淀粉合成基因的表達，該基因缺失會導致種子變大、直鏈淀粉含量增加以及支鏈淀粉結構發(fā)生改變[12]。在本研究中，wfzp1和wfzp2突變體穎果發(fā)育早期，胚乳細胞中淀粉體和蛋白體積累時間早、速度快，且淀粉體和蛋白體相對面積均顯著高于野生型濟麥22；穎果發(fā)育后期，突變體中的淀粉體和蛋白體的充實度更高，這說明WFZP基因的突變能夠在穎果發(fā)育時促進胚乳細胞的分化和生長。因此，推測AP2/ERF家族的WFZP基因可以通過調控穎果的發(fā)育，進而影響胚乳中淀粉和蛋白的積累。

前人探究了胚乳灌漿充實的整個過程，證實了糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞具有吸收和運輸養(yǎng)分的功能，對穎果的灌漿和儲藏物質的積累有重要的作用[5]。在本研究中，wfzp1和wfzp2突變體糊粉層傳遞細胞和胚乳傳遞細胞的生長發(fā)育速度較快，細胞壁內突的數(shù)量和厚度均高于濟麥22，更有利于灌漿物質的運輸，從而提高胚乳細胞中貯藏物質的積累速率。這說明wfzp1和wfzp2突變體養(yǎng)分運輸組織的結構發(fā)育特征與胚乳細胞中物質快速積累和大量充實緊密相關。本研究認為，WFZP基因參與了小麥穎果發(fā)育過程，對穎果內部貯藏物質的積累有一定調控作用，但有關該基因在小麥穎果發(fā)育過程中執(zhí)行的生物學功能尚不清楚，需要通過進一步的功能驗證來確定，本試驗可為進一步研究 AP2/ERF家族轉錄因子在谷物穎果發(fā)育過程中的功能提供理論 依據(jù)。