水楊酸和赤霉素預處理對NaCl脅迫下神香草種子萌發的影響

王 菲, 譚 怡, 呂亞茹, 蘇文欣, 姜宛彤, 劉宇樂, 嚴俊鑫

(東北林業大學園林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

施用植物激素和微量元素等對種子進行播前預處理是一項可有效提高種子活力的種子引發技術[1-2]。水楊酸(Salicylic acid，SA)和赤霉素(Gibberellin，GA)可參與調控植物種子萌發、根的生長、莖稈伸長、開花誘導和果實成熟等植物發育過程[3-4]，對植物產量、品質和抗逆性的提高有重要的促進作用。SA即鄰羥基苯甲酸，是一類酚酸物質，作為植物體內普遍存在的內源信號分子可與其他激素互相影響，誘導逆境相關抗性基因表達，激活系統抗性，從而提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性[5]；同時它能通過調節植物對各類營養元素的合理吸收和利用來維持植物體內的離子動態平衡[6]；另外，它還能緩解逆境脅迫對植物造成的膜質過氧化損傷，提高植物葉片的光合生產能力[7]。GA屬于雙萜類物質，它能促進細胞分裂和細胞伸長，加速葉芽生長，影響植物淀粉酶等代謝酶的活性，有效打破種子休眠[8]；它可通過腐蝕種皮蠟質層提高種皮透水和透氣性，增強種子呼吸速率，從而促進種子萌發[9]；并且它能誘導植物酶蛋白合成相關基因的表達，控制各種內源生長調節劑的分泌來提高種子活力，從而提高植物抵御脅迫的能力[10]。近年來，國內外施用SA、GA提高鹽脅迫條件下植物種子萌發和幼苗生長質量的研究較多，如王啟超等[11]對水楊酸緩解穿心蓮鹽脅迫的機制研究、朱秀紅[12]對三種泡桐、Shahzad K等[13]對玉米的研究，均指出適宜濃度的SA、GA能緩解鹽脅迫對植物造成的脅迫傷害，對種子萌發有一定促進效果。

土壤鹽漬化是由于土壤底層或地下水中的鹽在水分蒸發后不斷在地表積累造成的[14]。目前，全球鹽漬化土地面積已上升到9.54億公頃，而我國鹽漬化土壤面積達660.87萬公頃，主要分布在沿海、黃淮海平原、東北松嫩平原、西北半沙漠和青新極端干旱沙漠五大地區[15]，有不斷惡化的趨勢，嚴重阻礙了農業發展和生態恢復進程。根據鹽的種類和性質，鹽漬土可分為鹽土、堿土和過渡類型[16]，以NaCl等中性可溶性鹽為主的鹽土，一般土壤透氣性差，肥力低[17]，鹽離子濃度高，一定程度上對植物種子的萌發期和幼苗期構成威脅。種子萌發是植物生長發育的起始點，也是最易感知到鹽脅迫危害，影響其后續生長的重要階段。研究表明，鹽脅迫下高濃度的Na+會降低種子活力，減弱種子胚軸和子葉的氮代謝活動，使種子進入強迫性休眠；同時，在鹽脅迫下，土壤水勢下降導致植物根系吸水困難，植物體內水分虧缺甚至脫水，植物根系難以汲取營養物質，植物生長緩慢，植株體內Na+積累產生離子毒害，植物細胞內產生氧化脅迫，質膜損傷，滲透失衡，生理代謝紊亂[18-20]。

神香草(Hyssopusofficinalis)又名牛膝草，是一種唇形科(Lamiaceae)多年生草本。該植株地上部含有豐富的黃酮、揮發油、有機酸等化學成分[21]，在藥用、芳香療愈、精油提取方面[22]都有較高價值。因其具有耐干旱、抗寒等特點，在我國園林綠化中應用前景廣闊。但在其栽植過程中易遭受鹽堿脅迫、水分缺乏等危害，對其栽培及精油產量造成極大威脅[23]。目前，人們對神香草的研究多集中于栽培育苗、精油提取及應用[22,23]。兩種激素浸種處理對神香草種子的耐鹽能力的影響尚不清楚。因而，本試驗研究不同濃度SA和GA浸種對鹽脅迫下神香草種子萌發和生長的影響，以探究兩種激素對神香草耐鹽性的誘導作用，為解決鹽漬化地區園林植物栽培過程中的鹽害問題提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

神香草種子，2020年購自北京花兒朵朵花仙子農業有限公司。凈種后千粒重為1.04 g,含水量為0.31%，純凈度為97.37%，發芽率為70%左右。

1.2 方法

1.2.1種子前期處理 選取飽滿、大小一致的神香草種子，用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，蒸餾水沖洗5遍。使用濃度為0.2，0.4，0.6，0.8 mmol·L-1的SA溶液以及0.3，0.6，0.9，1.2 mmol·L-1的GA溶液浸種，分別記為SA0.2，SA0.4，SA0.6，SA0.8以及GA0.3，GA0.6，GA0.9，GA1.2，對照組用蒸餾水浸泡，記為SA0和GA0。24 h[24-26]后用蒸餾水沖洗3遍，用吸水紙吸干表面水分，備用。

根據前期預實驗，設置0，50，100，150，200 mmol·L-15個NaCl濃度梯度，記為T0，T50，T100，T150和T200。本實驗進行激素浸種和NaCl脅迫雙因素不同水平完全組合設計，前期浸種SA和GA分別設置5個濃度梯度(包含對照)，后期NaCl脅迫設置5個濃度，共計50個處理，每個處理3個重復。

1.2.2鹽處理 采用培養皿紙上發芽法，將浸泡風干后的種子置于直徑9 cm鋪有雙層濾紙的培養皿中，每個培養皿均勻放入50粒種子，向培養皿中加入5 mL不同濃度的鹽溶液。將培養皿置于黑暗培養箱中培養，模擬種子發芽前土壤中的黑暗條件。保持溫度25℃、濕度75%的環境條件，通過稱重法[27]每天16:00向培養皿內補充蒸餾水到初始重量，以保持處理液濃度不變。每隔24 h觀察統計神香草種子發芽指標，參照《GB/T 2930.4-2017草種子檢驗規程》[28]計算發芽率，第4天統計發芽勢(胚根伸出種子長度的1/2為發芽標準)，試驗周期為10 d。

1.2.3相關指標測定

1.2.3.1 萌發指標測定

不同GA和SA濃度預處理24 h后，用計數法每天記錄不同濃度鹽脅迫下的種子萌發數量，持續計數10天后計算種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數，計算公式如下：

發芽率(Gr)=(萌發種子數/供試種子數)×100%；

發芽勢(Ge)=(第4天種子發芽數/供試種子數)×100%；

發芽指數(Gi)=∑Gt/Dt；Gt為第t天的發芽數，Dt為相應的發芽試驗天數；

活力指數(Vi)=S×Gi，S為幼苗的生長勢，用根長表示[29]。

1.2.3.2 生長指標測定

胚芽、胚根長度測定：用游標卡尺測量幼苗的胚芽和胚根長度，每個處理隨機取10株幼苗(幼苗少于10株的處理，取所有的幼苗)，每組3次重復。

鮮重測定：試驗進行至第10 d時取神香草整株幼苗，每個處理隨機取10株(幼苗少于10株的處理，取所有的幼苗)，用濾紙擦干其表面水分后，稱其鮮重，每組3次重復[30]。

1.2.4模糊數學隸屬函數法 對鹽脅迫下神香草種子萌發和幼苗生長指標進行綜合評價[31]，計算發芽期和出苗期7項指標的隸屬函數值，將其平均值作為最終評價指標。計算公式為：

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：μ(Xj)代表第j個指標的隸屬函數值；Xj代表第j個指標值；Xmin代表第j個指標的最小值；Xmax代表第j個指標的最大值。

1.2.5數據處理 采用Excel 2016錄入數據，SPSS 22.0統計軟件對數據進行方差分析，Duncan進行多重比較，顯著性水平為P<0.05。所有實驗數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度SA對鹽脅迫下神香草種子萌發的影響

如圖1所示，在無鹽脅迫(T0條件)下，不同濃度SA處理后種子的發芽特性均高于對照處理，除SA0.8處理效果不明顯外，其他濃度均有顯著效果。隨NaCl濃度增大，神香草種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數呈下降趨勢，這說明神香草種子萌發特性明顯受到抑制。就發芽率而言，如圖1A所示，不同濃度NaCl處理下，SA0.2與SA0.4處理后提升效果均顯著(P<0.05)，在T50條件下，相比對照分別顯著增加19.99%，9.57%，但在T100和T200條件下，SA0.6與SA0.8相比對照無明顯變化。如圖1B所示，不同濃度SA處理均能提高鹽脅迫下種子發芽勢，在T50條件下，SA0.2能最大程度地提升發芽勢，而在T50～T200條件下，SA0.8提升效果始終不顯著。在圖1C中，不同濃度SA處理后，種子發芽指數均有不同程度的提升，且隨SA濃度增加緩解效果逐漸下降。對于種子的發芽指數和活力指數(圖1C、圖1D)，SA在T150和T200條件下提升效果均較弱。

圖1 不同濃度SA對鹽脅迫下神香草種子發芽率(A)、發芽勢(B)、發芽指數(C)、活力指數(D)的影響

2.2 不同濃度SA對鹽脅迫下神香草胚芽長、胚根長、鮮重的影響

如圖2所示，不同濃度NaCl條件下，SA0.2均能顯著提升幼苗胚芽長、胚根長和鮮重，在T100條件下，對種子胚芽的提升效果最好，相比對照顯著增加了53.01%(P<0.05)；在T50條件下，SA0.2處理使神香草胚根長、鮮重顯著增加了69.28%,44.48%(P<0.05)。如圖2A所示，就胚芽長而言，T0～T100條件下，以SA0.2和SA0.4處理效果較好，而在T200條件下，SA0.6，SA0.8提升效果不顯著。如圖2B所示，T150條件下，SA0.4～SA0.8處理后胚根長相比對照差異不顯著。如圖2C所示，T200條件下，SA0.4，SA0.6，SA0.8對神香草幼苗鮮重的提升效果不顯著，而在T50,T100條件下提升效果較顯著，T50條件下分別提升了30.77%，18.39%，16.32%。另外，本試驗發現無鹽脅迫(T0)條件下，SA0.4～SA0.8對種子鮮重無顯著影響。

圖2 不同濃度SA對鹽脅迫下神香草胚芽長(A)、胚根長(B)、鮮重(C)的影響

2.3 不同濃度GA對鹽脅迫下神香草種子萌發的影響

GA處理對無鹽脅迫下和鹽脅迫下神香草種子發芽特性均有促進效果，但促進效果因GA濃度存在差異。如圖3所示，鹽脅迫條件下GA處理后種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數隨GA濃度增加大致呈先上升后下降的趨勢，無鹽脅迫(T0)下，GA0.3，GA0.6對活力指數有明顯提升(圖3D)。如圖3A、B所示，各濃度鹽脅迫條件下，GA0.3，GA0.6均能顯著提升種子發芽率和發芽勢(P<0.05)。T100條件下，GA0.6處理后種子發芽率是對照組的1.56倍，緩解效果最為顯著(P<0.05)，而在T150條件下，GA0.6緩解效果低于GA0.3。T150和T200條件下GA0.6對種子發芽勢的緩解效果最佳，分別提升58.03%，154.73%。如圖3C、D所示，就發芽指數和活力指數而言，T50條件下GA的緩解效果明顯低于T100和T150。

圖3 不同濃度GA對鹽脅迫下神香草種子發芽率(A)、發芽勢(B)、發芽指數(C)、活力指數(D)的影響

2.4 不同濃度GA對鹽脅迫下神香草胚芽長、胚根長、鮮重的影響

由圖4所示，無鹽脅迫(T0條件)下，除GA0.9和GA1.2對胚芽長、胚根長、鮮重提升效果較弱外，其他GA濃度均能明顯促進幼苗生長。鹽脅迫下神香草幼苗生長指標隨GA濃度增大而呈現先上升后下降，不同濃度鹽脅迫條件下，GA0.6始終為幼苗胚芽長、胚根長和鮮重的峰值濃度。如圖4A所示，就胚芽長而言，GA0.3～GA1.2處理后均有提升，且緩解效果隨NaCl濃度升高而下降。GA0.6處理后幼苗胚芽長度在T50～T200條件下分別提升了33.41%，62.96%，61.19%，46.93%。如圖4B所示，T100和T150條件下，僅GA0.3～GA0.9提升幼苗胚根長度的效果顯著，而在T200條件下，各濃度GA處理后胚根均有顯著提升(P<0.05)。如圖4C所示，就幼苗鮮重而言，T150和T200條件下，GA0.3和GA0.6處理后有大幅度提升，T200條件下幼苗鮮重分別提升為對照的2.62，3.15倍。

圖4 不同濃度GA對鹽脅迫下神香草胚芽長(A)、胚根長(B)、鮮重(C)的影響

2.5 綜合評價

由表1所示，各處理的隸屬平均值代表了使用模糊數學隸屬函數法最終對神香草種子各指標的耐鹽性做出的綜合評價。T0條件下，隸屬函數平均值排序為GA0.6>GA0.3>SA0.2>GA0.9>SA0.4>GA1.2>SA0.6>SA0.8>CK。預處理使用0.2～0.8 mmol·L-1SA和0.3～1.2 mmol·L-1GA之后，各處理的隸屬函數值均高于對照組，這說明在無鹽脅迫條件下，SA和GA對神香草種子萌發期的發芽和幼苗生長起到一定的促進作用。T50～T200條件下，GA0.6綜合隸屬平均值始終位于第1，GA0.3在多數條件(T0，T50，T100，T150，T200)下排名位于第2，說明GA0.3和GA0.6處理后對于緩解不同濃度鹽脅迫有明顯效果。而SA0.2在T0～T200不同條件下，分別位于排名第3，4，2，3位，對于種子耐鹽性也有較好的提升效果。

表1 不同濃度SA和GA對鹽脅迫下神香草種子萌發的綜合評價

3 討論

3.1 SA對鹽脅迫下神香草種子萌發和生長的影響

發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數是種子發芽整齊度、發芽速度及種子活力的直接反映，也可用來鑒定其萌芽期的耐鹽性[32]。本研究中，不同濃度SA均能提高50～200 mmol·L-1NaCl脅迫下神香草種子發芽特性(萌發率提升最大程度在19%以上)，以0.2 mmol·L-1處理效果較好。這與王立紅發現0.2 mmol·L-1SA對鹽脅迫下棉花種子鹽害緩解效果最好的研究結果一致[33]，即SA一定程度上提高了神香草對鹽的耐受能力，降低了鹽脅迫對種子的傷害，其原因可能是SA通過水楊酸基因轉錄共激活蛋白調控Na+在細胞間的轉運[34]，調控離子吸收與分布以緩解離子毒害；同時SA作為一種天然植物激素信號分子，可協同其他激素誘導植物防御系統，激活抗氧化酶活性，緩解膜質過氧化，并使植物產生一定的抗鹽性狀，提高了植物對非生物逆境的抗性[35]。另外，其緩解程度隨SA濃度增大呈下降的趨勢，這與郝轉[36]研究SA對鹽脅迫下蘿卜種子萌發和幼苗生長的影響結論不同，該研究中，蘿卜種子發芽特性隨SA濃度升高逐漸上升，很可能是植物種類不同，對SA提升耐鹽能力的響應不同，本試驗中SA提升種子耐鹽的最適濃度也明顯低于蘿卜種子(1.5 mmol·L-1SA)，推測蘿卜對SA濃度的敏感性低于神香草。

由于外源激素濃度、鹽脅迫濃度不同，幼苗生長受到的緩解效應存在差異。本試驗條件下，神香草幼苗生長指標隨NaCl濃度增加明顯降低，但外源施加SA會使植物產生系統獲得性抗性[32]，提高幼苗生長速率，促進神香草幼苗胚芽、胚根生長，從而有效緩解鹽脅迫的抑制作用。另外，SA處理對50，100 mmol·L-1NaCl條件下胚芽、胚根、鮮重的緩解效果好于150和200 mmol·L-1NaCl脅迫。這與王瑩等[37]對辣椒、于麗麗等[38]對水飛薊研究結論存在差異，該研究認為SA對200 mmol·L-1NaCl下對幼苗生長和生理特性效果較好，說明對不同植物而言，SA處理可緩解的最適鹽脅迫濃度不同，推測是由植物本身的耐鹽性差異所致。

3.2 GA對鹽脅迫下神香草種子萌發和生長的影響

李翊華等[39]對黃瓜種子、楊曉平等[40]對甘藍種子的探討表明，適宜濃度的GA處理可有效緩解鹽脅迫對種子的危害，且低濃度GA條件下，種子發芽特性隨GA濃度變化呈上升趨勢，而高濃度條件下則呈下降趨勢，增加幅度明顯低于低濃度GA條件。這與本研究結果一致，其主要原因是GA能通過誘導植物相關基因表達提高植物體內生長素含量，誘導種子ɑ-淀粉酶合成，通過解除DELLA蛋白對GA信號轉導途徑的抑制[41]等方式有效破除種子休眠；一定濃度的赤霉素能不同程度地腐蝕種皮蠟質層[12]，提高種皮的透水、透氣性，增強種子的呼吸作用與生理生化代謝，促進胚生長，從而減緩鹽脅迫產生的傷害。本試驗中，適宜濃度的GA處理使神香草種子打破休眠并伴有較高的活力和發芽速度，有利于其抵抗鹽脅迫的危害，但GA濃度過大后又出現下降趨勢，可能是GA濃度過高對種子內部的生理代謝過程造成干擾，高于其適宜濃度范圍使緩解作用下降，不能使種子萌發效果提高。

胚芽、胚根長度以及鮮重是鹽脅迫下幼苗生長量的綜合反映。由于外源激素濃度、鹽脅迫濃度不同，幼苗生長受到的緩解效應存在差異。研究表明，GA可通過細胞伸長和細胞數目增加顯著促進鹽脅迫下幼苗的生長[42]，同時可提高水解酶活性，大量分解貯藏物質，從而增加植物養分積累、延緩幼苗衰老。本試驗中當GA處理濃度為0.3、0.6 mmol·L-1時，0～200 mmol·L-1NaCl脅迫下幼苗生長指標緩解效果比較顯著，其他GA濃度條件下緩解效果并不十分顯著。這與李穎[32]發現僅低濃度SA和ABA均能促進芽、根的伸長結論一致，說明外源物質適宜濃度的確定對于植物抵御脅迫有重要作用，推測是外源激素處理同時也存在一定的“劑量效應”。

3.3 SA和GA對無鹽脅迫下神香草種子萌發和生長的影響

植物激素在調控植物體內多種新陳代謝過程和生理反應中起著十分重要的作用。研究表明，施用植物激素浸種能打破種子休眠，減少阻礙種子萌發的相關物質[43]，有些激素還能起到促進植物細胞分裂和細胞伸長、莖桿生長、葉片擴展等作用[44]。本試驗中，無鹽脅迫條件下，經SA和GA預處理后，神香草種子的萌發能力和幼苗生長狀況均高于對照，表明兩種激素對神香草種子破除休眠、促進幼苗生長有一定的促進作用。以往研究中，陳姣等[45]發現，適宜濃度的水楊酸浸種處理可有效提高八月瓜葉片可溶性糖含量，從而促進其種子萌發及苗木生長；祿亞洲等[25]指出，外源水楊酸浸種可通過提高種子發芽勢、發芽指數和活力指數，進而促進種子萌發，并增強植物抗滲透脅迫能力，降低細胞膜脂過氧化損傷說明水楊酸浸種可促進種子發芽，提高種子出芽率和幼苗存活率；賈鑫等[43]在赤霉素和生長素浸種對多葉棘豆種子萌發的影響中指出，多葉棘豆種子在經過400 mg·L-1的GA浸種7小時后,發芽率、發芽勢、發芽指數和胚根長有所提高。但不同植物種子響應外源激素促進生長的最適濃度不同，由此說明，SA和GA對種子萌發有促進作用，不同植物對激素適宜濃度的閾值要求不同。

4 結論

種子的萌發期和幼苗期是植物對環境脅迫最敏感、耐受能力最低的階段。鹽脅迫作為一種非生物脅迫，通過影響植物的營養吸收、能量和物質代謝等生理過程嚴重限制了農藝和觀賞植物的生長和發育，降低了其產量和品質。本試驗研究了SA、GA預處理對不同濃度NaCl脅迫下神香草種子萌發的影響，結果表明，隨NaCl濃度增加，神香草種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數呈下降趨勢，生長指標也明顯低于對照。綜合分析表明，0.2～0.8 mmol·L-1的SA和0.3～1.2 mmol·L-1GA預處理均可提升0～200 mmol·L-1NaCl脅迫下神香草種子萌發和幼苗生長指標。經隸屬函數分析后顯示，0.6 mmol·L-1GA是緩解不同濃度NaCl脅迫神香草種子萌發和幼苗生長的最佳濃度。