早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊生長(zhǎng)性能、盲腸短鏈脂肪酸含量和菌群多樣性的影響

李永洙 楊 燕 金太花 韓照清 井文倩 魏明吉 李富寬 呂慎金*

(1.臨沂大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂276000；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂 276012)

盲腸作為反芻動(dòng)物后腸道，是補(bǔ)償消化過(guò)瘤胃纖維物質(zhì)的重要部位。盲腸內(nèi)富含有種類繁多的微生物，它們通過(guò)參與能量、碳水化合物、脂肪和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝來(lái)影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，在瘤胃功能尚未健全的羔羊生長(zhǎng)階段，盲腸起到重要的發(fā)酵作用。研究者們?cè)趯?duì)羊和兔等動(dòng)物盲腸微生物多樣性研究中均發(fā)現(xiàn)，此部位擁有大量與消化纖維素相關(guān)的菌群，這些菌群多樣性變化影響短鏈脂肪酸(Shortchain fatty acids，SCFA)含量，而SCFA產(chǎn)生的酸性環(huán)境能夠抑制腸道中病原菌的生長(zhǎng)，消化道前端未消化的纖維素性物質(zhì)是腸道后端細(xì)菌發(fā)酵的物質(zhì)來(lái)源，其主要的發(fā)酵產(chǎn)物SCFA能夠通過(guò)刺激上皮細(xì)胞的增殖來(lái)促進(jìn)盲腸的發(fā)育。因此，反芻、草食動(dòng)物盲腸菌落多樣性研究在近年來(lái)頗受關(guān)注。

沂蒙黑山羊是山東省肉皮絨兼用的地方優(yōu)良品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性好、抗病力強(qiáng)、板皮優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，但是也具有生長(zhǎng)速度緩慢，母羊空懷期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，早期斷奶對(duì)縮短沂蒙黑山羊母羊哺乳周期，提高繁殖率，降低培育成本等方面具有重要意義。沂蒙黑山羊一般3～4月齡進(jìn)行斷奶，斷奶方法多采用一次性斷開(kāi)，而為了母羊?qū)嵤└咝Ц哳l繁殖，采取40 d左右進(jìn)行早期斷奶，早期斷奶后哺喂代乳粉或者人工乳等措施，而早期哺喂代乳粉對(duì)25 d 后羔羊瘤胃微生物區(qū)系的變化明顯，但羔羊早期斷奶對(duì)盲腸部位菌群多樣性以及SCFA含量研究尚末見(jiàn)報(bào)道，尤其第8天早期斷奶對(duì)山羊生長(zhǎng)、盲腸菌群定植以及SCFA含量相關(guān)性研究更是鮮有報(bào)道。圍繞這些問(wèn)題，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析早期斷奶的沂蒙黑山羊盲腸細(xì)菌多樣性與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和腸道健康之間的關(guān)系，為早期斷奶羔羊飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年10月—2019年4月在山東省臨沂市沂南縣龍吟莊園黑山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社進(jìn)行。選用0 d沂蒙黑山羊羔羊36只(初生重(1.84±0.86)kg，均為公羊)，隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只，重復(fù)之間體重接近。B組為母乳組，隨母羊哺乳，R組為代乳粉組，于8 d起斷奶，10 d 完全哺喂代乳粉，兩組所有羔羊15 d起補(bǔ)飼開(kāi)食料直至75 d試驗(yàn)結(jié)束。期間于8、10、15、25、45和75 d時(shí)分別在各組隨機(jī)選取體重相近的3只羊進(jìn)行屠宰、收集盲腸內(nèi)容物樣品。屠宰前禁食、禁水16 h。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)所需代乳粉和開(kāi)食料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，代乳粉組成參照我國(guó)發(fā)明專利ZL201210365927.6。其營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，母乳營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表1 代乳粉和開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table 1 Nutrient levels of milk replacer and creep feed of starters(DM basis)

項(xiàng)目Item代乳粉Milkreplacer開(kāi)食料Creepfeed玉米/%Corn53.00豆粕/%Soybeanmeal27.00原料Ingredient小麥麩/%Wheatbran6.00預(yù)混料/%Premix①4.00苜蓿草粉/%Alfalfameal10.00合計(jì)/%Total100.00干物質(zhì)/%DM97.5886.59粗蛋白/%CP15.4020.80消化能/(MJ/kg)DE②11.1414.07CP/DE/(g/MJ)15.6013.90營(yíng)養(yǎng)水平Nutritionlevel粗脂肪/%EE15.433.77粗灰分/%Ash14.528.52粗纖維/%CF5.03鈣/%Ca1.020.95磷/%P0.660.70

①預(yù)混料為每千克飼糧提供。

The premix provided the following per kg of diets.V 12 000 IU, V 2 000 IU, V 30 IU, Cu(as copper sulfate)12 mg, Fe(as ferrous sulfate)64 mg, Mn(as manganese sulfate)56 mg, Zn(as zinc sulfate)60 mg, I(as potassium iodide)1.2 mg, Se(as sodium selenite)0.4 mg。

②營(yíng)養(yǎng)水平除消化能為計(jì)算值外均實(shí)測(cè)值，下同。

Nutrient levels were measured values except for DE.The same below.

表2 沂蒙黑山羊母乳不同階段的營(yíng)養(yǎng)及活性物質(zhì)水平

Table 2 Nutrient and active substance levels in different stages of Yimeng black sheep breast milk

項(xiàng)目Item10d45d75d干物質(zhì)/%DM14.6413.2812.78消化能/(MJ/kg)DE3.172.642.27粗蛋白質(zhì)/%CP5.723.723.10CP/DE/(g/MJ)18.0014.1013.70粗脂肪/%EE7.255.323.75粗灰分/%Ash1.210.890.67鈣/(mg/100g)Ca149.15128.83117.24總磷/(mg/100g)TP121.6496.2778.05乳糖/%Lactose4.624.183.20類胰島素因子/(ng/mL)IGF-12.872.041.12表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/(ng/mL)EGF30.4521.2816.64超氧化物歧化酶/(μg/mL)SOD17.6211.248.81

1.3 測(cè)定泌乳量、日糧以及飼養(yǎng)管理方法

1

.

3

.

1

體重、泌乳量、采食量的測(cè)定

測(cè)定8、10、15、25、45和75 d時(shí)晨8:00空腹時(shí)體重，根據(jù)各階段的始末體重計(jì)算平均日增重(ADG)。并各日齡節(jié)點(diǎn)當(dāng)天每次羔羊吮吸母乳前后的體重變化，計(jì)為母羊的平均泌乳量。羔羊吮吸母乳后離開(kāi)母羊，放回羔羊舍并給于準(zhǔn)確稱量開(kāi)食料，喂料時(shí)間為9:00—第二天9:00，記錄投料量及后1天的剩料量，計(jì)算羔羊開(kāi)食料采食量和干物質(zhì)采食量(DMI)，根據(jù)各階段始末體重計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率(F/G)。

1

.

3

.

2

母乳、代乳粉和開(kāi)食料營(yíng)養(yǎng)成分分析

依據(jù)常規(guī)分析法測(cè)定母乳、代乳粉以及開(kāi)食料中相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分。另外，母乳活性物質(zhì)中類胰島素因子(IGF-1)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、超氧化物歧化酶(SOD)均采用雙抗體夾心生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ABC-ELISA)，兩種生長(zhǎng)因子試劑盒均為美國(guó)R&D公司進(jìn)口分裝試劑盒。采用DNM-9602G型酶標(biāo)分析儀測(cè)定吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1

.

3

.

3

飼養(yǎng)管理

將試驗(yàn)羔羊打上耳號(hào)，在通風(fēng)、光線良好的半開(kāi)放式圈舍中單籠飼養(yǎng)。R組羔羊0～7 d隨母羊哺乳，8 d時(shí)開(kāi)始由母羊哺乳逐漸過(guò)渡到飼喂代乳粉，至10 d時(shí)與母羊分開(kāi)，完全飼喂代乳粉。代乳粉飼喂前用煮沸后冷卻至50 ℃的熱水按代乳粉∶水=1∶5 沖泡，再冷卻至(40±1)℃飼喂。每次飼喂后及時(shí)用干凈的毛巾將羔羊嘴邊的乳液擦拭干凈。羔羊均于15 d開(kāi)始訓(xùn)練采食相同的開(kāi)食料，自由采食和飲水。

1.4 樣品的采集及處理

各日齡段完成各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定后，當(dāng)日16:00禁食、禁水，次日8:00屠宰。屠宰時(shí)采用頸靜脈放血，屠宰并打開(kāi)腹腔，分割出盲腸后立即結(jié)扎，將盲腸置于無(wú)菌操作臺(tái)上，提取內(nèi)容物，并放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?0、45和75 d羔羊哺乳前收集 60 mL 母乳，以6 000 r/min速度，4 ℃離心20 min，棄去上層乳脂和沉淀物，取上清液至-80 ℃冰箱凍存，備用。

1.5 盲腸內(nèi)容物SCFA含量測(cè)定

參照Xiao等方法，取0.1 g左右盲腸內(nèi)容物，置于1.5 mL離心管中，加入9倍體積(mL)的超純水，混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL裝于1.5 mL離心管中，再加入0.2 mL的25%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))偏磷酸與巴豆酸混合溶液，-20 ℃過(guò)夜保存。上樣前使用0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，濾液12 000 r/min離心10 min，然后取500 μL 上清液，利用氣相色譜測(cè)定SCFA含量。

1.6 羔羊盲腸細(xì)菌基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用 CTAB方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 5400檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用16S V3-V4 rDNA通用引物(341F：CCTACGGGCTGCAACAG；806R：GGACTACCAGGGTATCTAAT)并帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，確認(rèn)文庫(kù)合格后，送至諾禾致源公司使用HiSeq2500 PE250(Illumina, USA)進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。

1.7 16S rRNA高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

基于Illumina MiSeq PE250測(cè)序平臺(tái)獲取的raw reads，首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)其序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾。利用Uparse軟件(http:∥www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣本的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)。

對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA138(http:∥www.arbsilva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)各樣本的群落組成。

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，Rank abundance曲線，物種累積曲線并使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，

n

=3；以Duncan氏方法進(jìn)行多重比較，日增重、SCFA與菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析在https:∥magic.nov-ogene.com/customer/main/login系統(tǒng)中進(jìn)行Spearman分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊生長(zhǎng)性能的影響

從表3可見(jiàn)，B組10 d時(shí)泌乳量顯著高于R組(

P

<0.05)，而隨著日齡增加，泌乳量以及代乳粉哺喂量逐漸減少，兩組間差異不顯著(

P

>0.05)；從表4 可見(jiàn)，R組代乳粉中日均干物質(zhì)采食量均低于B組，而開(kāi)食料中日均干物質(zhì)采食量均高于B組，且R組代乳粉和開(kāi)食料日均干物質(zhì)采食量總和高于B組，但差異不顯著(

P

>0.05)。表明早期斷奶對(duì)羔羊代乳粉吸乳量具有一定的影響，且促進(jìn)開(kāi)食料的采食量。

表3 沂蒙黑山羊不同日齡母乳泌乳量和代乳粉哺喂量

Table 3 Breast milk production and milk substitute powder feeding quantity Yimeng black lambs at different age g

日齡/dDaysofageB組BgroupR組Rgroup10489.5±23.5b441.4±32.4a15504.1±34.6492.8±25.725662.6±46.5644.4±16.545342.5±26.8334.2±29.475230.7±21.2252.0±34.2

注：同一日齡組肩標(biāo)為不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(<0.05)。大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(<0.01)。下同。

Notes: Different superscript lowercases in the same age group mean significant difference(<0.05)and different capital letter superscripts mean extremely significant difference(<0.01).The same below.

表4 沂蒙黑山羊羔羊不同日齡段日均干物質(zhì)采食量

Table 4 Average daily DM intake of Yimeng black lambs at different age

項(xiàng)目Item日齡/dDaysofageB組采食量/gDMintakeinBgroupR組采食量/gDMintakeinRgroup11～1570.74±4.1666.44±2.61代乳粉Milkreplacer15～2579.37±3.7575.37±5.4225～4567.20±2.4262.43±4.2745～7537.48±1.7236.29±3.4715～25118.72±9.71132.62±18.42開(kāi)食料Creepfeed25～45192.83±12.83202.38±16.5545～75423.14±16.47467.38±18.83總量Total11～75989.48±87.241042.91±74.85

從表5可見(jiàn)，0和10 d時(shí)兩組間體重差異不顯著(

P

>0.05)，而15 d時(shí)B組體重大于R組，且差異極顯著(

P

<0.01)；隨著日齡增長(zhǎng)，R組生長(zhǎng)較快，45 d時(shí)已超過(guò)B組(

P

>0.05)，且75 d時(shí)顯著高于B組(

P

<0.05)。R組在11～15 d間日增重極顯著的低于B組(

P

<0.01)，而在25～45 d和45～75 d 間日增重均顯著高于B組(

P

<0.05)。R組在11～15 d和25～25 d間料重比均高于R組(

P

>0.05)，而在25～45 d和45～75 d間均低于B組，且在45～75 d間差異顯著(

P

<0.05)。表明早期斷奶影響羔羊前期日增重，而25 d后隨著開(kāi)食料采食量的增加R組日增重顯著高于B組。

表5 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊體重的影響

Table 5 Effects of artificial rearing of milk replacer on body weight gain of Yimeng black lambs

分組Group日齡/dDaysofage體重/kgBW日增重/gADG料重比/%F/G01.84±0.07102.29±0.13152.65±0.11B253.69±0.12B組Bgroup454.93±0.04757.66±0.26a11～1572.06±8.93B1.00±0.0415～25115.56±7.311.73±0.1225～4565.26±9.02a3.99±0.2545～7594.14±3.47a9.05±0.37b01.85±0.09102.23±0.08152.46±0.08A253.58±0.05R組Rgroup455.07±0.28758.40±0.31b11～1546.21±6.39A1.47±0.0615～25112.00±6.651.89±0.1025～4578.42±5.65b3.42±0.1645～75114.83±6.73b7.91±0.28a

注：不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(<0.01)。

Notes: Different capital letter superscripts mean extremely significant difference(<0.01).

2.2 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

由圖1可見(jiàn)，R組和B組羔羊在45和75 d盲腸短鏈脂肪酸含量均顯著高于10、15和25 d(

P

<0.05)，且75 d時(shí)其含量顯著高于45 d(

P

<0.05)。R組羔羊25 d時(shí)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸含量顯著高于15 d(

P

<0.05)。B組羔羊45 d時(shí)各類短鏈脂肪酸含量均顯著高于25 d(

P

<0.05)。說(shuō)明兩組間盲腸內(nèi)容物分解產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸水平上存在時(shí)差，即R組在25與15 d間，B組在45與25 d間變化較為明顯。另外，相同日齡段B組與R組間乙酸、丙酸和異戊酸變化呈現(xiàn)10～15 d間B組大于R組，25 d后R組大于B組的現(xiàn)象；丁酸和異丁酸變化呈現(xiàn)10～45 d間B組大于R組，75 d時(shí)R組大于B組的現(xiàn)象；戊酸在10～75 d間變化B組大于R組現(xiàn)象，但各日齡段組間差異均不顯著(

P

>0.05)。表明與母乳組相比，早期斷奶羔羊可提前影響盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸分解。

圖中不同字母左上角#表示B組間差異，*表示R組間差異。

2.3 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

從表6可見(jiàn)，Sobs、Ace和Chao1指數(shù)在15 d時(shí)均差異顯著(

P

<0.05)，Shannon及Simpson指數(shù)在25 d時(shí)呈現(xiàn)差異顯著(

P

<0.05)。表明R組10 d全部斷奶后1～2周盲腸微生物多樣性、豐度的明顯降低。

表6 沂蒙黑山羊羔羊盲腸菌群Alpha多樣性分析

Table 6 Alpha diversity analysis of cecal microflora in Yimeng black lambs

日齡/dDaysofage組別GroupSobsAceChao1ShannonSimpson8/ 284 389 3742.920.64710B 299 431 4073.200.735R 369 485 4663.860.83215B 653a 807a 794a5.280.891R 441b 581b 554b4.100.81725B 618 791 7625.01a0.888aR 528 719 7002.82b0.503b45B 930107410456.910.967R 867 927 9195.910.93475B1048127812666.350.931R1102129612957.250.977

在門(mén)(Phylum)水平上豐度排名前10物種見(jiàn)圖2。圖中可見(jiàn)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)細(xì)菌數(shù)量總和占各組樣品中細(xì)菌總數(shù)的90%以上。其中，F(xiàn)irmicutes門(mén)的相對(duì)豐度8 d時(shí)達(dá)88.08%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，10 d后R組逐漸下降，到25 d時(shí)達(dá)最低值21.96%，之后遞增到75 d時(shí)56.95%，與8 d比較，25和45 d時(shí)顯著下降(

P

<0.05)，而15、25和45 d時(shí)低于B組，且25 d時(shí)差異顯著(

P

<0.05)；B組10～75 d間維持在40%～55%水平，與8 d比較，10和15 d時(shí)顯著下降(

P

<0.05)，75 d時(shí)極顯著下降(

P

<0.01)。與此相同，Proteobacteria門(mén)相對(duì)豐度8 d時(shí)達(dá)5.14%，10 d后R組逐漸上升，到25 d 時(shí)達(dá)到峰值38.47%，隨后遞減到75 d時(shí)6.76%，且在10和45 d時(shí)差異極顯著(

P

<0.01)。與此相反，Bacteroidetes門(mén)相對(duì)豐度8 d時(shí)達(dá)3.6%，10 d后R組逐漸上升，到45 d時(shí)達(dá)到峰值45.7%，與8 d比較，各日齡段逐步上升，尤其在25 d后顯著上升(

P

<0.05)，除45 d時(shí)以外均低于B組，且在75 d時(shí)差異顯著(

P

<0.05)；B組10～45 d時(shí)維持在30%～40%水平，與8 d比較，10和25 d時(shí)顯著上升(

P

<0.05)。表明斷奶早期由于腸道內(nèi)外環(huán)境的變化導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，而斷奶后期逐漸適應(yīng)日糧過(guò)渡和腸道內(nèi)新環(huán)境，進(jìn)而影響菌群豐度。

圖2 不同日齡沂蒙黑山羊羔羊門(mén)水平上盲腸細(xì)菌組成分析

在屬水平上盲腸內(nèi)菌群豐度排名前10的物種見(jiàn)圖3。圖中可見(jiàn)，擬桿菌屬(

Bacteroides

)、丁酸球菌屬(

Butyricicoccus

)、乳酸桿菌屬(

Lactobacillus

)、瘤胃球菌屬(

Ruminococcaceae_UCG-005

)、韋榮氏球菌屬(

Veillonella

)為前5菌屬。其中，

Butyricicoccus

屬相對(duì)豐度8 d時(shí)達(dá)58.32%，10 d后兩組均顯著下降(

P

<0.05)，在25 d時(shí)兩組均急劇下降(

P

<0.01)。

Lactobacillus

屬相對(duì)豐度8 d時(shí)達(dá)15.83%，15 d后急劇下降，除25 d以外均低于B組，且在15 d時(shí)差異顯著(

P

<0.05)。表明R組斷奶15 d后隨著羔羊?qū)﹂_(kāi)食料和飼養(yǎng)條件的適應(yīng)，擬桿菌等菌屬相對(duì)豐度逐漸升高并超過(guò)母乳組，而此類菌屬的逐步定植有助于斷奶羔羊后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解。

Others：其他；Alistipes：未知屬；Megasphaera：巨球型菌；Romboutsia：未知屬；Intestinibacter：未知屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Escherich-iaShigella：大腸桿菌志賀氏菌屬；Ruminococcus_gnavus_group：活潑瘤胃球菌屬；Butyricimonas：丁酸弧菌屬；Clostridium_sensu_stricto_1：狹窄梭菌屬_1；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌屬R-7；Barnesiella：巴恩斯氏菌；Megamonas：巨單胞菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺旋菌NK4A136屬；Prevotella_1：普雷沃氏菌屬_1；Parasutterella：副翅菌屬；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌屬RC9菌群；Roseburia：羅氏菌屬；Paeniclostridium：未知屬；Holdemanella：霍爾德曼氏菌屬；unidentified_Ruminococcaceae：未知屬瘤胃球菌科；Eubacterium_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真桿菌屬；Chlamydia：衣原體屬；Faecalibacterium：棲糞桿菌屬；Veillonella：韋榮氏球菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃菌UCG-005屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬。

2.4 沂蒙黑山羊羔羊盲腸菌群與日增重、短鏈脂肪酸含量的相關(guān)性分析

與日增重的相關(guān)性菌群分析中發(fā)現(xiàn)(圖4)，15 d時(shí)B組

Clostridium

_

sensu

_

stricto

_1屬相對(duì)豐度顯著高于R組(

P

<0.05)；25 d時(shí)B組

Peptoclostridium

和

Intestinibacter

屬相對(duì)豐度顯著高于R組(

P

<0.05)，而

Clostridium

_

sensu

_

stricto

_1屬差異極顯著(

P

<0.01)；45 d時(shí)B組

Butyrivibrio

_2和

Prevotellaceae

_

UCG-003

屬相對(duì)豐度極顯著低于R組(

P

<0.01)。

(a)、(b)和(c)分別代表15、25和45 d與日增重相關(guān)的菌群豐度。

與短鏈脂肪酸生成相關(guān)的菌群相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖5，與乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸生成相關(guān)的

Akkermansia

屬相對(duì)豐度在25 d時(shí)B組顯著高于R組(

P

<0.05)；與乙酸和丁酸生產(chǎn)相關(guān)的

Clostridium

_

sensu

_

stricto

_1屬相對(duì)豐度在25 d時(shí)R組顯著高于B組(

P

<0.05)；與丁酸、戊酸生成相關(guān)的

Butyrivibrio

_2屬相對(duì)豐度在45 d時(shí)R組極顯著高于B組(

P

<0.01)，而與異丁酸和戊酸生成相關(guān)的

Prevotellaceae_UCG-003

屬相對(duì)豐度在 45 d 時(shí)R組顯著高于B組(

P

<0.05)；與異丁酸生成相關(guān)的

Unidentified

_

Ruminococcaceae

屬相對(duì)豐度在45 d時(shí)R組顯著高于B組(

P

<0.05)。表明斷奶后代乳粉和開(kāi)食料的早期使用，促進(jìn)35 d左右的菌群定植和營(yíng)養(yǎng)代謝，而代謝產(chǎn)物丁酸作為盲腸能量的首選來(lái)源，影響后腸道養(yǎng)分的再吸收。

(a)～(f)分別代表乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸。

3 討 論

3.1 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊生長(zhǎng)性能的影響

早期斷奶會(huì)影響幼齡家畜的消化代謝功能發(fā)揮，由于幼齡斷奶會(huì)引起腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，抑制幼齡家畜正常的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，選擇合適的斷奶時(shí)間有利于斷奶后羔羊體重的增加。本研究發(fā)現(xiàn)，由于斷奶后羔羊的適應(yīng)性等方面的緣故，代乳粉組25 d前體重、日增重低于母乳組，而45 d后代乳粉組高于母乳組，這與前人的研究結(jié)果類似。原因是由于羔羊斷奶過(guò)早產(chǎn)生應(yīng)激較大，并且斷奶羔羊?qū)Υ榉塾幸粋€(gè)胃腸道內(nèi)環(huán)境逐漸適應(yīng)過(guò)程，影響代乳粉組羔羊正常消化吸收。另外，25 d后母乳中活性物質(zhì)含量顯著下降導(dǎo)致母乳的營(yíng)養(yǎng)成分已不能滿足羔羊生長(zhǎng)需要，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育，相反優(yōu)質(zhì)代乳粉可以給羔羊提供全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，彌補(bǔ)母乳營(yíng)養(yǎng)成分的不足。有研究報(bào)道，斷代乳品越晚，瘤胃發(fā)育越成熟，其對(duì)固體飼料的承受力較強(qiáng)，提高其采食量，并且斷奶越早，開(kāi)食料采食量越高，是由于斷奶后只有開(kāi)食料作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源且時(shí)間跨度越長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，11～75 d期間代乳粉組代乳粉和開(kāi)食料日均干物質(zhì)采食量總和高于母乳組，而25 d時(shí)代乳粉組前期料重比高于母乳組，之后逐漸降低，這與前人的研究結(jié)果一致。

3.2 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

有研究報(bào)道，剛出生的幼齡動(dòng)物腸道微生物種類單一且含量極少，在此種情況下,盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量較低，然而隨著日齡的增加，盲腸菌群結(jié)構(gòu)逐漸完善，所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸上升明顯。本研究顯示，隨著日齡增加兩組短鏈脂肪酸含量逐漸上升，而代乳粉組與母乳組間盲腸內(nèi)容物分解產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸水平上存在時(shí)差。說(shuō)明斷奶組比母乳組提前影響盲腸內(nèi)容物分解，而作為擬桿菌門(mén)發(fā)酵的主要產(chǎn)物丙酸與丁酸，15～45 d間擬桿菌門(mén)豐度變化促進(jìn)25 d后丙酸和丁酸生成。乙酸、丙酸和丁酸等SCFA是微生物利用營(yíng)養(yǎng)素的重要代謝產(chǎn)物，可以調(diào)節(jié)腸腔pH，減少病原菌的定殖，緩解由病原菌引起的腸道感染和炎癥。由此可見(jiàn)，兩組間生成短鏈脂肪酸水平上存在時(shí)差，有助于代乳粉組盲腸提前增強(qiáng)腸道的屏障功能，有利于腸道健康。這與本研究中羔羊生長(zhǎng)性能的改善可能有一定關(guān)系。

3.3 早期斷奶對(duì)沂蒙黑山羊羔羊盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

哺乳動(dòng)物剛出生后隨著與外部環(huán)境的接觸，胃腸道內(nèi)不斷定植各種微生物，其組成受到多種因素的影響。由于宿主胃腸道菌群與體外微生物的雙向選擇，絕大部分菌群被抑制或消失，少部分菌群適應(yīng)于胃腸道內(nèi)環(huán)境而開(kāi)始定植繁衍，并逐漸形成復(fù)雜而龐大的微生物區(qū)系。本研究結(jié)果顯示，與母乳組相比，代乳粉組15 d時(shí)Ace指數(shù)和25 d時(shí)Shannon指數(shù)差異明顯，并且隨日齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，直到75 d時(shí)Alpha多樣性超過(guò)母乳組，說(shuō)明代乳粉組斷奶后7～14 d間盲腸菌群多樣性明顯下降，菌群結(jié)構(gòu)維持簡(jiǎn)單化。

大量研究表明，反芻動(dòng)物胃腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，厚壁菌門(mén)是促進(jìn)動(dòng)物胃腸道微生物分解纖維素的最主要菌群，而擬桿菌門(mén)是促進(jìn)動(dòng)物利用碳水化合物的最主要菌群。本研究結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌，但沂蒙黑山羊瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)，說(shuō)明不同胃腸段菌群定植存在一定的差異，并且已有研究表明盲腸中優(yōu)勢(shì)菌群受到品種、年齡及飼養(yǎng)環(huán)境影響。本研究發(fā)現(xiàn)，代乳粉組厚壁菌門(mén)變化略推遲于母乳組，擬桿菌門(mén)被抑制呈現(xiàn)低于母乳組狀況，這兩種菌群豐度分布的差異，可能是由于斷奶后早期羔羊的不同日糧組成(母乳、代乳粉)影響了胃腸道消化吸收功能，進(jìn)而導(dǎo)致盲腸部位的未消化纖維含量不同。有研究證實(shí)，腸道變形菌門(mén)能夠?qū)е挛⑸鷳B(tài)失調(diào)或不穩(wěn)定的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，代乳粉組變形菌門(mén)斷奶后呈先開(kāi)后降狀態(tài)，而45 d后趨于平穩(wěn)，并與母乳組持相同水平。說(shuō)明斷奶早期由于腸道內(nèi)外環(huán)境的變化導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，而斷奶后期逐漸適應(yīng)日糧過(guò)渡和腸道內(nèi)新環(huán)境，進(jìn)而影響變形菌門(mén)菌群的豐度；相反，由于母羊飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)水平等原因，并且母乳產(chǎn)生了營(yíng)養(yǎng)水平變化、細(xì)菌感染幾率增加等隱患，導(dǎo)致盲腸菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本研究得出，在屬水平上兩組相對(duì)豐度最高5屬均為擬桿菌屬，并在45 d后代乳粉組相對(duì)豐度高于母乳組，瘤胃球菌屬25 d時(shí)代乳粉組相對(duì)豐度超過(guò)母乳組，說(shuō)明斷奶早期擬桿菌屬、瘤胃球菌屬被抑制，而到25 d后逐漸消除斷奶應(yīng)激的干擾。除此之外，擬桿菌門(mén)的

Parasutterella

、

Prevotella

_1屬和厚壁菌門(mén)的

Rikenellaceae

_RC9_gut_group屬均呈現(xiàn)與擬桿菌屬、瘤胃球菌屬相似趨勢(shì)，說(shuō)明代乳粉組斷奶15 d后隨著羔羊?qū)﹂_(kāi)食料和飼養(yǎng)條件的適應(yīng)，盲腸中擬桿菌等菌屬相對(duì)豐度逐漸升高并超過(guò)母乳組，而此類菌屬的逐步定植有助于斷奶后期羔羊胃腸道分解纖維素以及促進(jìn)碳水化合物利用。由此可見(jiàn)，早期斷奶后羔羊胃腸道中如何調(diào)整擬桿菌屬、瘤胃球菌屬等菌屬的穩(wěn)定性，將是早期斷奶羔羊飼養(yǎng)管理上需要改進(jìn)的一項(xiàng)技術(shù)措施。另外，兩組在10 d后丁酸球菌屬相對(duì)豐度均出現(xiàn)急劇下降現(xiàn)象，說(shuō)明該菌屬不受斷奶應(yīng)激的影響，至于為何下降乃至消失的原因需要進(jìn)一步研究。諸多研究表明，幼兔和雛鵝等盲腸段均檢測(cè)到乳酸桿菌，表明乳酸桿菌是不同家畜盲腸中普遍存在的有益菌，但是該菌群在不同畜種中含量差距較大，其中，該菌群是雛鵝中盲腸部位的優(yōu)勢(shì)菌群，而在其它畜種中均不是優(yōu)勢(shì)菌群。本研究顯示，乳酸桿菌隨著日齡的增長(zhǎng)逐漸下降，而代乳粉組平均下降幅度(67.98%)明顯高于母乳組(46.65%)，并且韋榮氏球菌屬在10和15 d時(shí)代乳粉組相對(duì)豐度均高于母乳組。在盲腸部位由于乳酸桿菌降低和韋榮氏球菌升高，會(huì)引起早期斷奶羔羊患疾病的風(fēng)險(xiǎn)大大提高，然而斷奶35 d后擬桿菌屬和瘤胃球菌屬等豐度的升高，有利于早期斷奶羔羊維持腸道正常的生理功能和微生態(tài)平衡，促進(jìn)碳水化合物降解和多糖物質(zhì)代謝等養(yǎng)分代謝，提高飼料轉(zhuǎn)換率。

3.4 沂蒙黑山羊羔羊盲腸菌群與體重、短鏈脂肪酸含量的相關(guān)性分析

盲腸作為微生物消化的主要場(chǎng)所，其菌群代謝可以產(chǎn)生有機(jī)酸，為動(dòng)物機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)可以提高宿主對(duì)蛋白質(zhì)和能量的利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。

Clostridium

_

sensu

_

stricto

_1屬是引起腸道疾病的厭氧或微需氧的粗大芽孢桿菌。本研究結(jié)果顯示，斷奶后5 d時(shí)

Clostridium

_

sensu

_

stricto

_1屬相對(duì)豐度開(kāi)始上升，到15 d時(shí)其豐度上升更加迅速，而

Intestinibacter

屬相對(duì)豐度上升，可以降低菌毛的黏附力，導(dǎo)致乙酸、丙酸和丁酸等SCFA生成明顯下降。另外，斷奶后15 d時(shí)代乳粉組

Akkermansia

屬代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸顯著降低，影響腸道通透性并抑制免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答能力下降，從而導(dǎo)致生產(chǎn)性能發(fā)揮受到影響。

Butyrivibrio

_2屬可分解多種碳水化合物，丁酸是主要的代謝產(chǎn)物。與此相同，

Prevotellaceae

_

UCG-003

屬主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸及少量的異丁酸、異戊酸和乳酸。本研究結(jié)果顯示，代乳粉組45 d時(shí)

Butyrivibrio

_2屬相對(duì)豐度顯著高于母乳組，并且在45 d時(shí)

Prevotellaceae_UCG-003

屬與乙酸、異丁酸和異戊酸生成能力顯著高于母乳組，而斷奶后35 d左右普氏菌屬的增加，說(shuō)明斷奶后代乳粉和開(kāi)食料的早期使用，可以促進(jìn)35 d左右的菌群定植和營(yíng)養(yǎng)代謝，而代謝產(chǎn)物丁酸作為盲腸能量的首選來(lái)源，能被結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收利用，影響后腸道養(yǎng)分的再吸收，促進(jìn)淀粉和纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。同時(shí)，SCFA本身是一種能量物質(zhì)，可被宿主利用，參與宿主的能量代謝。在人體上的研究結(jié)果表明，肥胖個(gè)體腸道中SCFA的含量要顯著高于消瘦個(gè)體。由此可見(jiàn)，25 d后代乳粉組盲腸短鏈脂肪酸提前顯著變化與其斷奶后羔羊生長(zhǎng)發(fā)育有密切相關(guān)。至于羔羊斷奶后盲腸菌群定植與代謝相關(guān)基因表達(dá)間的因果關(guān)系還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

沂蒙黑山羊羔羊早期斷奶，使前期日增重受到限制且盲腸菌群多樣性下降，而斷奶后15 d時(shí)可加快盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸短鏈脂肪酸的生成，并且斷奶35 d后促進(jìn)桿菌屬和瘤胃球菌屬等有益菌定植，改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝。