莖瘤芥編碼生長素響應因子基因在逆境脅迫下的表達分析

蔡兆明，程春紅，傅 敏，王殿東

(長江師范學院 生命科學與技術學院，重慶 408100)

生長素在植物生長發育以及對環境適應方面具有重要作用，如參與調控植物器官發育、對生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫的響應等[1-3]。生長素主要通過一系列蛋白組成的生長素信號通路發揮功能，該信號轉導通路上游主要包含3個基因家族成員，即TIR1/AFB生長素受體家族蛋白、AUX/IAA家族蛋白和生長素響應因子ARF家族蛋白[4]。當植物內源生長素含量升高時，生長素分子結合并激活生長素受體TIR1/AFB，被激活的TIR1/AFB可與AUX/IAA蛋白結合并通過泛素-26S蛋白酶體途徑將其降解，隨著AUX/IAA蛋白的降解，該蛋白對ARF轉錄因子的抑制作用被解除，進而引發對下游生長素響應基因的轉錄調控，激活生長素信號通路[5]。

ARF家族基因作為生長素信號通路的組分之一，在植物生長發育過程的許多方面均具有調控作用。在擬南芥中，共有23個ARF基因被鑒定出來，不同的ARF基因所發揮的功能也具有多樣性。如ARF1和ARF2可調節擬南芥葉片衰老和花的凋謝，且在功能上存在冗余[6]。ARF3通過與細胞分裂素信號的互作調控擬南芥花原基的形成[7]。ARF8可影響擬南芥中茉莉酸的含量并在調節下胚軸伸長、頂端優勢和側根形成方面發揮功能[8]。在番茄中，相比于野生型番茄，ARF4基因缺失突變體對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性增強[9]。在楊樹中，過表達ARF1可以增加植株對木霉菌侵染的響應[10]。

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)為十字花科蕓薹屬植物，是重慶地區的重要經濟作物之一，其膨大莖是制作中國名特產品“涪陵榨菜”的主要原料。榨菜產業可貢獻很大的經濟效益，僅重慶涪陵區2020年的榨菜產業總產值為120億元，為大量莖瘤芥種植農戶帶來收益。為實現重慶地區的優勢榨菜產業可持續發展，重慶蔬菜產業發展“十三五”規劃中把強化科技創新，注重研發高產優質的榨菜加工專用品種作為工作重點。在莖瘤芥栽培過程中，瘤莖產量低、鹽脅迫和根腫菌脅迫等問題仍對榨菜產業發展帶來巨大挑戰。基于生長素在調控植物器官發育、植物抵御生物和非生物逆境脅迫中的多方面作用，本研究以生長素信號通路中的重要組分ARF家族基因為研究對象，對這些基因在莖瘤芥生長發育過程和逆境條件下的表達模式進行檢測，挖掘出一些在瘤莖中特異表達的以及對鹽脅迫和根腫菌脅迫有響應的ARF基因成員，為進一步研究它們的功能奠定基礎，同時為研發高產優質莖瘤芥品種提供潛在的基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料及培養

試驗所用莖瘤芥材料為重慶地區栽培品種永安小葉。將種子播種在含蛭石∶營養土(3∶1)的花盆中，在植物培養室中進行培養，培養溫度為22 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗。對生長至生育期的植物各組織(根、莖、葉、花、種莢)進行取樣，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱，用于后續表達檢測試驗。鹽脅迫處理方法為：選取培養室中培養2周齡的莖瘤芥幼苗，用200 mmol/L的氯化鈉灌根處理0，6，12，24，48 h后對幼苗根系進行取樣，其中以灌根處理的0 h的幼苗根系作為對照；根腫菌脅迫處理方法為：選取2周齡的莖瘤芥幼苗，用5 mL根腫菌休眠孢子提取液(OD600=0.07)灌根處理0，12，24，36，72 h后對幼苗根系取樣，其中以灌根處理的0 h的幼苗根系作為對照，根腫菌休眠孢子的提取參照杜艷等[11]的試驗方法。每個處理的樣品各取3株材料混樣，取樣進行3次生物學重復，用于后續基因表達分析。

1.2 生物信息學分析

在蕓薹屬基因組網站(http：//brassicadb.cn/#/)中的莖瘤芥基因組數據庫(BrassicajunceaV1.5)中下載莖瘤芥ARF家族基因，基因ID參照Li等[12]發表的文章。利用DNAMAN和MEGA 7軟件將莖瘤芥ARF家族蛋白與擬南芥ARF蛋白序列進行同源比對，依據比對結果對莖瘤芥ARF家族基因重新命名，以便直觀顯示與擬南芥ARF家族各成員高度相似的莖瘤芥基因。通過莖瘤芥基因組網站提供的信息統計莖瘤芥ARF的基因組長度、蛋白編碼序列(CDS)長度、氨基酸長度及外顯子數目。采用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預測蛋白等電點及分子量。采用TBtools軟件進行基因串聯重復分析以及計算ARF片段復制基因對的Ka/Ks值[13]。選擇莖瘤芥ARF家族各基因“ATG”上游2 kb序列作為啟動子，采用在線分析軟件PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)進行啟動子順式作用元件分析。

1.3 莖瘤芥總RNA提取及基因的qPCR檢測

采用SimGEN公司(杭州，中國)的植物總RNA提取試劑盒，參照試驗方法說明對莖瘤芥材料的總RNA進行提取，使用全式金公司(北京，中國)的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將提取出的總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄加入模板RNA的用量為500 ng。將反轉錄得到的cDNA稀釋10倍用于qPCR檢測。采用羅氏(Roche)Light Cycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀進行qPCR分析，使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒配制10 μL反應體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix，5 μL；cDNA 0.5 μL；正向引物(10 μmol/mL)0.5 μL；反向引物(10 μmol/mL)0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。反應程序為：94 ℃ 30 s；(94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，收集熒光信號)，40個循環；運行溶解曲線程序。qPCR反應所用，內參基因為莖瘤芥Bju18SrRNA(BjuA046942)[14]，所用引物序列見表1。

表1 BjARF基因qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qPCR for BjARF genes

表1(續)

1.4 數據統計分析

采用2-ΔΔCT方法對qPCR結果數據進行分析，計算各基因相對于內參基因的表達量。使用Heml軟件對ARF基因在莖瘤芥不同組織中表達的qPCR檢測結果進行熱圖分析，利用SigmaPlot 10.0(Systat Software，Inc.，Chicago，IL，United States)軟件對鹽脅迫和根腫菌侵染脅迫的莖瘤芥根中ARF基因表達檢測結果進行分析并作圖，使用SPSS 16.0軟件進行基因表達水平比較，選擇One-way ANOVA的Duncan方法進行基因表達差異顯著性檢驗，P<0.05時認為不同樣本間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 莖瘤芥ARF基因基本信息分析

通過蛋白序列比對分析了莖瘤芥ARF蛋白與擬南芥ARF蛋白的序列一致性，并根據序列一致性的高低分別對莖瘤芥ARF基因重新命名(表 2)。結果表明，莖瘤芥中與擬南芥ARF5序列相似度較高的基因數目最多，為6個，分別命名為BjARF5A～BjARF5F，用同樣的方法也對其他基因進行了重新命名。基因長度分析結果表明，莖瘤芥ARF基因長度在1 685(BjARF17B)～4 814 bp(BjARF7C)，CDS長度在1 167(BjARF13C)～3 594 bp(BjARF7C)，蛋白氨基酸序列長度在388(BjARF13C)～1 197 aa(BjARF7C)。對蛋白等電點的分析結果表明，莖瘤芥ARF蛋白等電點大小在5.19(BjARF17A)～8.55(BjARF17B)，其中大部分等電點小于7，呈弱酸性。蛋白分子量分析結果表明，莖瘤芥ARF蛋白分子量在44.44(BjARF13C)～132.64 ku(BjARF7C)。

表2 莖瘤芥ARF基因信息及蛋白理化性質Tab.2 Gene information and protein physicochemical properties of ARF genes of tuber mustard

表2(續)

通過采用TBtools軟件在莖瘤芥全基因組進行搜索并未發現串聯重復的ARF基因對，但存在多個片段復制的ARF基因對，同時對這些基因對的Ka/Ks值進行了計算，結果表明，除BjARF4A∶BjARF4B基因對的Ka/Ks值沒有得出外，其他16個基因對的Ka/Ks值均小于1，說明莖瘤芥ARF基因在進化過程中受到純化選擇壓力的影響(表3)。

表3 莖瘤芥ARF片段復制基因對Ka/Ks分析Tab.3 Analysis of Ka/Ks in ARF fragment replication gene pairs in tuber mustard

2.2 莖瘤芥ARF基因啟動子順式作用元件分析

為預測莖瘤芥ARF基因在響應鹽脅迫和病原菌脅迫方面可能發揮的功能，對ARF各基因啟動子所含有的相關順式作用元件進行了分析。結果表明(圖1)，主要包含2種響應生長素相關的順式作用元件(ARFAT和CATATGGMSAUR)，一種響應生長素和水楊酸的順式作用元件(ASF1MOTIFCAMV)，2種響應病原菌相關的順式作用元件(GCCCORE和MYB1LEPR)，一種響應病原菌侵染和鹽脅迫相關的順式作用元件(GT1GMSCAM4)。其中，35個ARF基因啟動子含有ARFAT元件，27個啟動子含有CATATGGMSAUR元件，這2個元件是受生長素誘導表達的基因通常含有的，說明大部分莖瘤芥ARF基因均與生長素信號通路密切相關。所有ARF基因均含有2個以上GT1GMSCAM4元件，其中多個基因啟動子上該元件數目超過10個，這些基因可能在莖瘤芥響應鹽脅迫過程中具有功能。響應病原菌侵染的順式作用元件GCCCORE和MYB1LEPR僅在少數ARF基因啟動子上存在，且只含有一個，而響應效應子和病原菌侵染的順式作用元件ELRECOREPCRP1則在25個啟動子上被預測到，由于莖瘤芥主要病害根腫菌的效應子在其侵染莖瘤芥過程中具有重要作用，因此，啟動子含有多個該元件的ARF基因，如BjARF9C(5個)、BjARF3D(3個)、BjARF13B(3個)可能在莖瘤芥抵御根腫菌過程中發揮功能。

圖1 莖瘤芥ARF啟動子順式作用元件分析Fig.1 Analysis of cis-elements in the promoter of ARF genes of tuber mustard

2.3 莖瘤芥ARF基因在不同器官中的表達分析

為探究不同ARF基因在莖瘤芥各個組織中可能發揮的功能，采用qPCR的方法對莖瘤芥根、莖、膨大莖、葉、花和種莢中的基因表達水平進行了檢測，并利用2-ΔΔCT法計算了各個ARF基因相對于內參基因Bju18SrRNA的表達量。結果表明，相比于其他基因，BjARF1A、BjARF3D、BjARF4B和BjARF18B在檢測的6個組織中相對表達量均較高(圖2)，推測這4個基因在莖瘤芥的各個組織中可能類似看家基因一樣具有廣泛的調控作用。BjARF1B、BjARF2A、BjARF2B、BjARF2C、BjARF2D、BjARF3A、BjARF4A、BjARF5E、BjARF5F、BjARF13A、和BjARF17D則至少在1個組織中具有較高的表達水平，說明這些基因可能對1個或幾個組織生長發育的調控作用均有貢獻。其他所檢測的基因在各組織中的表達水平差異不大。通過組織表達水平檢測還鑒定到一些在某一特定器官中具有高表達的基因，如相比于其他組織，BjARF1A和BjARF4B在葉中表達水平高，BjARF7C在根中表達水平高，BjARF2B和BjARF2C在種莢中表達水平最高；而BjARF6A雖然在各組織中的表達水平均較低，但其在膨大莖中的表達水平要高于其他5個組織，類似的BjARF7A在花組織中有特異的表達。這些在單一組織中具有特異表達模式的ARF基因值得進一步對其在調控該組織生長發育中的功能進行研究。

圖2 莖瘤芥ARF基因在不同器官中的表達模式檢測Fig.2 The investigation of expression patterns of ARF genes in different organs of tuber mustard

2.4 莖瘤芥ARF基因在鹽脅迫條件下的表達分析

為鑒定出可能參與莖瘤芥響應鹽脅迫過程中發揮功能的ARF基因，對200 mmol/L的NaCl處理0～48 h的莖瘤芥根中的ARF基因表達水平進行了檢測。結果表明，相比于對照，BjARF1B和BjARF2B在鹽處理3 h后受到強烈的誘導表達，分別是未處理對照的40，303倍(圖3)，推測這2個基因在莖瘤芥響應鹽脅迫的最初期可能發揮較大作用。此外，BjARF13E在鹽脅迫處理6 h后表達水平上調14倍，BjARF9A在鹽脅迫處理6 h后表達水平上調6倍，這2個基因也很可能在鹽脅迫響應過程中發揮功能。同時，還檢測到多個基因在鹽脅迫處理48 h內持續下調表達，如BjARF2D、BjARF3A、BjARF6B、BjARF6C、BjARF10B和BjARF13A，其中BjARF2D和BjARF6B在鹽處理3～48 h持續顯著下調，而另外4個基因則在鹽處理3 h后即顯著下調，后期則在某一時間點有所恢復(圖3)。這些鑒定到的受鹽脅迫處理誘導表達或抑制表達的ARF基因可能參與莖瘤芥根系對鹽脅迫的響應及可塑性發育，值得作為研究重點進一步研究它們在莖瘤芥抗鹽方面的功能。

2.5 莖瘤芥ARF基因在根腫菌脅迫條件下的表達分析

為鑒定出可能參與莖瘤芥響應根腫菌侵染過程中發揮功能的ARF基因，對根腫菌休眠孢子處理0～72 h的莖瘤芥根中的ARF基因表達水平進行了檢測。結果表明，相比于對照，BjARF3A和BjARF3D的表達水平分別在根腫菌侵染12，24 h后顯著上調，如BjARF3D在72 h的表達水平為對照的4.6倍，在24 h的表達水平則達到對照的82倍(圖4)，這2個強烈受根腫菌侵染誘導表達的基因很可能在這一過程中發揮重要作用。BjARF13B在根腫菌處理6～72 h的表達量連續下調，且趨勢逐漸加強，在處理72 h后，表達量已下降至0 h對照的2%，說明莖瘤芥很可能通過抑制該基因的表達完成對根腫菌侵染的響應，進一步驗證該基因在莖瘤芥抵抗根腫病中的作用有重要意義。BjARF17C和BjARF18A在根腫菌處理12～72 h顯著下調表達，說明這2個基因可能在這幾個時間段發揮重要功能。這些在根腫菌侵染過程中表達顯著變化的基因，無論受到誘導還是抑制作用，均可能在此過程中發揮作用，其具體生物學功能有待進一步驗證。

圖4 莖瘤芥ARF基因在根腫菌脅迫處理條件下表達模式檢測Fig.4 The investigation of expression patterns of ARF genes in tuber mustard under Plasmodiophora brassicae stress treatment

3 討論

在進化上，片段重復、串聯重復和基因組重復是基因擴張的主要方式[15]。莖瘤芥是白菜(Brassicarapa)和黑芥(B.nigra)雜交所得的異源四倍體進化而來，基因組加倍是莖瘤芥ARF基因數目增加的主要動力[16]。同時，在莖瘤芥中存在多個ARF片段復制基因對，且受到純化選擇壓力的影響，這也是ARF基因進化的動力之一。但是，在莖瘤芥中不存在串聯重復產生的ARF基因對，與之相似，在大麥(Hordeumvulgare)和谷子(Setariaitalica)中也未發現串聯重復的ARF基因對[17-18]。啟動子上的順式作用元件對于基因的表達具有重要作用，經啟動子預測發現，BjARF3D啟動子含有3個響應病原菌和效應子的ELRECOREPCRP1元件，基因表達檢測結果也發現該基因在根腫菌侵染24 h后其表達水平上調82倍，充分利用生物信息學分析與表達檢測分析可為挖掘有價值的基因進行后續功能研究提供重要依據。已有研究表明，在大豆GmARF啟動子上同樣發現6個與生長素密切相關的CATATGGMSAUR作用元件，且該基因在下胚軸的表達受到生長素2，4-D的顯著誘導[19]，由該順式作用元件在不同物種ARF基因啟動子中被發現這一情況可推測其對生長素信號通路基因發揮功能具有重要意義。

基因的組織表達模式通常和它們所發揮的功能密切相關，在莖瘤芥中鑒定到一些在某一特定組織中高表達的基因，如BjARF1A和BjARF4B在葉中的表達水平高于其他組織，說明這2個基因與莖瘤芥葉的發育及功能相關。已有研究報道，在棉花(Gossypiumraimondii)和桐油樹(Physicnut)的葉組織中也檢測到ARF4的高表達[20-21]，這些證據進一步說明ARF4在調控葉片功能方面在多個物種中相對保守。生長素在調控植物根的可塑性發育方面發揮作用，其中ARF7和ARF19在植物側根發育和根的向地性方面具有較大貢獻，擬南芥arf7arf19雙重缺失突變體表現為側根發育受抑制的表型[22]。在莖瘤芥中，BjARF7C在根中的相對高表達水平預示著該基因在莖瘤芥根系發生發育過程中可能也具有類似的調控作用。此外，莖瘤芥是一種莖食作物，其膨大莖的生長狀況與其產量密切相關，通過基因表達模式檢測發現，BjARF6A在膨大莖中的相對表達水平較高，可對該基因進一步深入研究以明確其調控瘤莖發育的具體功能，可為培育優質莖瘤芥品種提供潛在的基因資源。

鹽脅迫是主要的非生物逆境脅迫之一，也是莖瘤芥栽培過程中面臨的主要逆境，在莖瘤芥中挖掘一些影響植物耐鹽相關的ARF基因可為緩解莖瘤芥因鹽脅迫造成減產的現狀提供幫助。在甘薯(Ipomoeabatatas)中，ARF5基因在鹽脅迫處理2～48 h之間受到誘導表達，同時在擬南芥中過表達該基因可增加植株對鹽脅迫的耐受性[23]。在本研究中，4個莖瘤芥ARF基因受鹽脅迫的誘導表達，預測它們也很有可能在莖瘤芥抗鹽過程中發揮正調控作用。而在番茄(Solanumlycopersicum)中，抑制ARF4的表達則可增強植株對鹽脅迫的耐受性[9]，莖瘤芥中有7個ARF基因的表達水平受到鹽脅迫的抑制作用，說明它們調控植物響應鹽脅迫的方式可能與番茄ARF5類似。同為生長素信號通路的ARF基因，在鹽脅迫條件下有的被誘導，而有的被抑制，可能是由于它們的結構不同而導致發揮功能的方式上存在差異，產生這種情況的可能是由于ARF作為轉錄因子，一些具有轉錄激活活性，一些具有轉錄抑制活性有關[24]。

生長素信號通路基因通常參與到植物對病原菌的防御反應中，如木薯對炭疽病的響應和擬南芥對丁香假單胞菌的抗性[25-26]。在單子葉植物慈竹(Bambusaemeiensis)中也發現，受害蟲脅迫后，多個ARF基因上調表達[27]。在根腫菌處理條件下，在莖瘤芥中鑒定出2個顯著上調表達的ARF基因(BjARF3A和BjARF3D)，目前，已知ARF3在調控雌蕊發育中發揮功能且該功能在十字花科不同物種中保守[28]，但其在其他方面的功能還未見報道，深入對它們在莖瘤芥響應根腫菌方面的功能研究可增加對該基因功能的認識。目前，在芥菜類植物中鑒定到的抗病相關的ARF基因仍然較少，在芥菜(Brassicajuncea)中過表達來源于白芥(Sinapisalba)的ARF10可增強芥菜對脫落酸的敏感性和對甘藍鏈格孢菌(Alternariabrassicicola)的抗性[29]。在莖瘤芥中采用過表達或基因沉默的方法可進一步驗證這些受根腫菌侵染誘導或抑制表達的ARF基因在莖瘤芥抗根腫病方面的相關功能。