云南省4個主栽馬鈴薯品種葉片內生細菌多樣性研究

楊金睿，王文倩，王 玥，姚 遙，吉 澤，李俊逸，陳 斌，肖關麗

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201)

內生菌(Endophyte)是指長期定殖于植物各種組織內但不引起該植物表觀癥狀的一類微生物[1]，包括內生細菌、真菌和放線菌，在各類植物中普遍存在[2]，廣泛分布于植物的各種組織和器官內。植物內生細菌能產生植物激素、自身固氮等直接參與促進植物生長，增強植物抵御病原菌侵染的能力[3]，也可通過生成代謝產物或是借助信號轉導途徑來影響宿主的生長發育[4]，也有一些內生細菌能通過生成某些功能性代謝物而提高宿主對環境的適應性[5]。此外，有些植物內生細菌的代謝產物對昆蟲具有毒殺或抑制作用[6]。隨著內生細菌在植物生物防治和生理生態方面作用的認識，植物內生細菌已成為國內外農業等多個領域研究的重點[7]。馬鈴薯作為云南省主要糧食作物之一，其種植面積和產量位居全國前列[8]，且栽培品種較多，其中青薯9號、會-2、合作88和麗薯6號等為云南省馬鈴薯主栽品種。云南地形地貌復雜，環境多變，不同地區栽培品種不同，所受逆境脅迫、病蟲害等危害也不相同，研究云南省主栽品種馬鈴薯葉片內生細菌的種類組成和差異，可為馬鈴薯內生菌資源及其與馬鈴薯互作關系研究提供理論依據。

當前研究報道的馬鈴薯內生細菌主要來自塊莖，對于馬鈴薯葉片內生細菌研究與發掘鮮有報道，云南是我國馬鈴薯種植和產量大省，其主栽馬鈴薯品種葉片內生細菌種類多樣性的研究尚處于空白階段。本試驗通過分子生物學鑒定并結合形態學鑒定的方法，對云南4個主栽馬鈴薯品種青薯9號、會-2、麗薯6號和合作88葉片內生細菌進行分離培養和種屬鑒定，分析4個馬鈴薯品種葉片內生細菌種類組成的多樣性和差異，為篩選抗蟲、抗病原菌和抗旱等功能的內生細菌以及進一步應用于云南馬鈴薯生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種：采用青薯9號、會-2、合作88和麗薯6號一級種薯，均由云南省會澤縣農技中心提供。

LB培養基：NaCl 10 g、酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調整為7.0～7.2[19]。

試劑及儀器：細菌通用引物27 F和1492 R、Taq PCR Mix 預混液(濃度為2×, 含藍染料)、雙蒸水(ddH2O)、綠色熒光核酸染料(上海生物工程股份有限公司)；瓊脂糖(廣州賽國生物科技有限公司)。2-16R型離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)；Mastercycler?nexus型PCR儀(德國Eppendorf公司)；DYY-7C型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與處理 4個品種均選用質量50 g左右并帶2～3個芽眼，芽長0.5～1.0 cm，根據國標馬鈴薯種薯GB 18133-2012劃分為一級種的優良種薯，并剔除具有病害、畸形等損傷的種薯。將挑選好的種薯種植于罩籠內花盆(口徑：50 cm，高：50 cm)，以防止害蟲侵害。選用含沙量多、通氣性能好的沙質土作為基質，所有品種栽培管理方法一致，每個品種種植10盆，放置于大棚中進行管理。待各品種生長至薯塊發生期時(播種后50 d)，從每個品種長勢一致的植株中部展開復葉上剪取無病蟲害侵害癥狀、完整、健康的葉片，每個品種選取5盆作為重復，取樣后即放入密封袋并貼上標簽，帶回實驗室進行內生菌的分離。

稱取各品種新鮮馬鈴薯葉片自來水沖洗3～5次，葉片表面水分用無菌濾紙擦干，無菌水充分漂洗3次，75%的酒精充分浸泡1 min，無菌水再漂洗3次，3% NaClO溶液浸泡1 min，無菌水充分漂洗3次，75%酒精浸泡30 s，最后無菌水再漂洗3次[20]。把最后一次漂洗的無菌水涂布于LB培養基上作為空白對照，以驗證葉片表面消毒是否徹底。

1.2.2 馬鈴薯葉片內生細菌的分離與培養 采用組織研磨法和組織切塊法分離內生細菌[21]。

組織研磨法：取1 g表面消毒馬鈴薯葉片樣品，用無菌剪刀剪碎放入無菌研缽，加適量無菌水研磨成勻漿狀，吸取100 μL勻漿涂布于LB固體培養基上，5次重復。

組織切塊法：將表面消毒好的葉片樣品剪切為0.5 cm×0.5 cm的小塊平放于LB固體培養基上，每個培養基上均勻放置5個小塊，5次重復。

將上述LB培養基放置于(25±1)℃的恒溫培養箱中培養72 h，每天8：00定時觀察，及時挑取顏色形態不同的菌落于配置好的LB培養基上培養，再對菌落編號并統計各細菌菌落的數量，待完全純化為單菌株后于4 ℃冰箱保存備用。統計每種菌株的數量后計算其相對多度，相對多度=某個種的株數/全部種的總株數×100%。

1.2.3 馬鈴薯內生細菌的菌種鑒定 細菌形態學鑒定：把分離純化得到的菌株在LB培養基上劃線培養，并參考《伯杰細菌鑒定手冊》對其菌落顏色、形態和干濕程度等進行記錄鑒定。并采用革蘭氏染色法對各細菌染色，觀察細菌細胞形態及其革蘭氏陰陽性。

細菌分子鑒定：采用凍溶法提取內生細菌菌株基因組DNA[22]。具體過程為：從已純化好菌株的LB平板上挑取適量單菌落加入裝有500 μL無菌水的1.5 mL無菌離心管中，渦旋振蕩1～2 min，使菌體和無菌水振蕩混勻。再把混勻后裝有菌液的離心管置于液氮中冰凍10 min，然后取出將其固定于漂浮盤上沸水水浴5 min，最后再12 000 r/min離心2 min，得到的上清液即可作為PCR模板備用。加入細菌16S rRNA基因擴增通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，反應體系為25 μL：引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq PCR Mix 預混液(濃度為2×, 含藍染料)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR儀設置反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產物進行凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR產物由上海生物工程股份有限公司進行雙向測序。

用Contigexpress軟件對各菌株測序得到的2條序列進行校對、拼接，把拼接好的序列提交至NCBI查找相似度最高的典型菌株并下載序列。運行MEGA 7.0軟件采用國際通用的鄰位相連法(Neighbour-Joining)并設置Kimura′s 2-parameter模型構建系統發育樹，重復抽樣1 000次進行Bootstrap驗證，分析系統進化樹拓撲結構的穩定性。

2 結果與分析

2.1 4個馬鈴薯葉片內生細菌菌落形態及種類組成

從4個馬鈴薯品種葉片中共分離到內生細菌59株。青薯9號、會-2、合作88和麗薯6號分離到內生細菌分別是11，13，17和18株。根據各品種葉片內生細菌菌落形態、細胞形態特征和細菌種類組成，將其具體描述如表1。

表1 馬鈴薯葉片內生細菌菌落形態及種類組成Tab.1 Colony morphology and species composition of the endophytic bacteria in potato leaves

表1(續)

2.2 4個馬鈴薯品種葉片內生細菌的系統發育

青薯9號馬鈴薯葉片中內生細菌系統發育樹由3個大支構成。第1大支由厚壁菌門來自葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、微小桿菌屬的菌株構成；第2大支由放線菌門來自兩面神菌屬、考克氏菌屬和微球菌屬的菌株構成；第3大支由變形菌門來自假單胞菌屬、短波單胞菌屬和副球菌屬的菌株構成(圖1)。

圖1 基于16S rDNA序列青薯9號葉片內生細菌菌株的系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the endophytic bacteria strains in Qingshu No.9 leaves based on 16S rDNA sequence

從系統發育樹來看，考克氏菌屬的菌株YQ8與微球菌屬的菌株YQ11、短波單胞菌屬的菌株YQ7和副球菌屬的菌株YQ9分別聚為1小支，表明這些菌株之間親緣關系較為相近。

會-2馬鈴薯葉片內生細菌系統發育樹由4個大支構成。第1大支由變形菌門來自不動桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、短波單胞菌屬的菌株構成；第2大支由厚壁菌門來自虛構芽孢桿菌屬、微小桿菌屬的菌株構成；第3大支由放線菌門來自紅球菌屬、微桿菌屬、短桿菌屬的菌株構成；第4大支由擬桿菌門來自金黃色桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬的菌株構成(圖2)。

圖2 基于16S rDNA序列會-2葉片內生細菌菌株的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the endophytic bacteria strains in Hui-2 leaves based on 16S rDNA sequence

從系統發育樹來看，鞘氨醇單胞菌屬的菌株QH4與短波單胞菌屬的菌株YH10、微桿菌屬的菌株YH3和短桿菌屬的菌株YH8分別聚為1小支，表明這些不同屬菌株之間的親緣關系較為相近。

合作88馬鈴薯葉片內生細菌系統發育樹由4個大支構成。第1大支由放線菌門來自兩面神菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、考克氏菌屬的菌株構成；第2大支由厚壁菌門來自虛構芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬的菌株構成；第3大支由變形菌門來自副球菌屬、沙雷氏菌屬、不動桿菌屬的菌株構成；第4大支由擬桿菌門來自鞘氨醇桿菌屬的菌株單獨構成(圖3)。

圖3 基于16S rDNA序列合作88葉片內生細菌菌株的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the endophytic bacteria strains in Hezuo No.88 leaves based on 16S rDNA sequence

從系統發育樹來看，兩面神菌屬的菌株YZ17、YZ4和微桿菌屬的菌株QZ1、微球菌屬的菌株YZ13和考克氏菌屬的菌株YZ9、YZ14分別聚為1小支，表明這些不同屬菌株之間親緣關系較為相近。

麗薯6號馬鈴薯葉片內生細菌系統發育樹由4個大支構成。第1大支由厚壁菌門來自葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、虛構芽孢桿菌屬、微小桿菌屬的菌株構成；第2大支由放線菌門來自紅球菌屬、微桿菌屬的菌株構成；第3大支由變形菌門來自不動桿菌屬的菌株單獨構成；第4大支由擬桿菌門來自鞘氨醇桿菌屬的菌株單獨構成(圖4)。

圖4 基于16S rDNA序列麗薯6號葉片內生細菌菌株的系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the endophytic bacteria strains in Lishu No.6 leaves based on 16S rDNA sequence

從系統發育樹來看，芽孢桿菌屬的菌株YL16與虛構芽孢桿菌屬的菌株QL3、QL4先聚為一支，而不是先與同一芽孢桿菌屬的菌株QL1、QL2聚為1支，表明了即使同一個屬中也存在不同種的菌株之間親緣關系不相近的情況，而這些菌株可能與其他屬的菌株親緣關系更為接近。

2.3 4個馬鈴薯品種葉片內生細菌種類組成差異

從4個馬鈴薯品種葉片中分離培養獲得可培養內生細菌37種。其中青薯9號馬鈴薯葉片中可培養細菌共3門8科9屬10種，會-2葉片中可培養細菌共4門11科11屬12種，合作88葉片中可培養細菌共4門9科10屬13種，麗薯6號葉片中可培養細菌共4門7科8屬17種。

從門級水平來看，4個馬鈴薯品種葉片分離到的內生細菌屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門。青薯9號葉片中可培養內生細菌屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，其相對多度分別是45.45%，27.27%，27.27%。會-2葉片中可培養內生細菌屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門，其相對多度分別是15.38%，23.08%，46.15%，15.38%。合作88葉片中可培養內生細菌屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門，其相對多度分別是17.65%，35.29%，41.18%，5.88%。麗薯6號葉片中可培養內生細菌屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門，其相對多度分別是61.11%，16.67%，16.67%，5.56%。試驗表明，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門的細菌均占了4個品種中可培養細菌的絕大多數，為優勢門類；擬桿菌門的細菌只在會-2、合作88和麗薯6號中存在，且相對多度均很小(圖5)。

圖5 4個馬鈴薯品種葉片內生細菌在門級水平上的相對多度Fig.5 Relative abundances of the endophytic bacteria at the phylum levels in four potato varieties leaves

從科級水平來看，4個馬鈴薯品種葉片共有的可培養內生細菌為芽孢桿菌科的菌株；耶爾森菌科的菌株僅在合作88葉片中獲得，皮桿菌科、鞘脂單胞菌科、周蝶菌科的菌株僅在會-2葉片中獲得。葡萄球菌科、微球菌科在青薯9號葉片中相對多度達到最高，均為18.18%；莫拉菌科和假單胞菌科在會-2葉片中相對多度達到最高，均為15.38%；莫拉菌科在合作88葉片中相對多度達到最高，為23.53%；芽孢桿菌科在麗薯6號葉片中相對多度達到最高，為27.78%(圖6)。

圖6 4個馬鈴薯品種葉片內生細菌在科級水平上的相對多度Fig.6 Relative abundances of the endophytic bacteria at the family levels in four potato varieties leaves

從屬級水平來看，除沙雷氏菌屬的菌株僅在合作88品種葉片中分離到，短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、金黃色桿菌屬的菌株僅在會-2中獲得之外，其他屬的菌株均存在于2個或3個馬鈴薯品種葉片中。本研究從4個馬鈴薯品種葉片中共分離到18個屬的細菌，葡萄球菌屬和微小桿菌屬是青薯9號的優勢菌屬，相對多度均為18.18%；不動桿菌屬和假單胞菌屬是會-2的優勢菌屬，相對多度均為15.38%；不動桿菌屬是合作88的優勢菌屬，相對多度為23.53%；葡萄球菌屬是麗薯6號的優勢菌屬，相對多度為22.22%(圖7)。

圖7 4個馬鈴薯品種葉片內生細菌在屬級水平上的相對多度Fig.7 Relative abundances of the endophytic bacteria at the genera levels in four potato varieties leaves

3 討論與結論

本研究從云南省4個主栽馬鈴薯品種青薯9號、會-2、合作88和麗薯6號葉片中分別分離培養獲得內生細菌10，12，13，17種，均屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門細菌，與馬鈴薯塊莖內生細菌門水平上組成有一定相似，如戴超[23]從山東省濰坊市的馬鈴薯塊莖中分離獲得11門50個屬的內生細菌，主要為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和軟壁菌門，其中厚壁菌門為最豐富的門類。Liu等[24]從內蒙古馬鈴薯塊莖中分離到3門18屬37種內生細菌，優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門。Sessitsch等[25]從奧地利馬鈴薯塊莖中分離到內生細菌15屬21種，優勢菌門為變形菌門。除細菌門類組成外，從屬的水平上來看其內生細菌組成與馬鈴薯塊莖內生細菌也存在相同之處，如戴超[23]發現芽孢桿菌屬是馬鈴薯塊莖中內生細菌較為豐富的內生菌屬，該屬細菌也在本研究中青薯9號和麗薯6號分離培養到。其次，Sessitsch等[25]從成熟馬鈴薯塊莖中分離到假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬細菌，本研究也從供試的馬鈴薯品種葉片中分離培養得到該2個菌屬的菌株，而對于這2個屬的細菌在馬鈴薯其他生育期是否同樣存在還值得進一步探究。Liu等[24]從4 ℃冷藏保存的馬鈴薯塊莖中分離到微桿菌屬、紅球菌屬和短桿菌屬細菌，本研究中從合作88、會-2和麗薯6號馬鈴薯葉片中也分離到這3個菌屬的細菌，因此，馬鈴薯葉片中的這些內生細菌有可能在低溫響應中發揮著重要作用，從而適應4 ℃或更低溫度的脅迫，這也將是進一步深入研究的內容。此外，不同內生細菌分離方法分離到的細菌種類和數量也存在差異。本研究采用組織研磨法和組織切塊法分離馬鈴薯葉片內生細菌。組織研磨法是對馬鈴薯葉片組織進行充分研磨并涂布于LB培養基上；其優點在于能使葉片中的內生細菌充分與培養基接觸，進而分離到更多的可培養內生細菌，但也容易在研磨和涂布過程中因操作處理時間較長而損失部分內生細菌。組織切塊法則將表面消毒好的葉片組織剪成小塊，使組織塊切面與培養基表面接觸，一定時間后內生菌沿切面長出；該方法相對簡便易行，操作時間短，且沿切面長出的菌生長快，適應性強，但因菌落只能沿切面長出，導致該方法分離出的細菌數量較少。因此，本研究采用2種方法相結合，使其盡可能分離到更多的可培養內生細菌。

本研究發現，云南省4個主栽馬鈴薯品種葉片中分離到的內生細菌多數為厚壁菌門和變形菌門，這2個門類的細菌同時也廣泛存在于取食馬鈴薯的寡食性害蟲馬鈴薯塊莖蛾幼蟲腸道中[26]。從屬和種水平上來看，雖然各馬鈴薯品種葉片中可培養內生細菌的種類組成和豐度存在差異，即不同品種的優勢菌屬和細菌種類不同，但是從4個馬鈴薯品種中分離到的部分菌屬，如微桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單孢菌屬等的菌株也存在于很多不同種類植物中[27-28]；沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬的細菌則是當前應用較多的生防及促生細菌，具有調節植物內源激素水平、抑制植物病原菌和抵御蟲害等的作用[28-30]。因此，本研究供試馬鈴薯品種葉片中存在的沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬的內生細菌，可能就是不同馬鈴薯品種在生長發育、抗病蟲害和抗逆等方面存在差異的重要原因之一。

植物內生菌在植物生長發育以及對環境的適應性中發揮著重要作用，不同內生菌所具有的生理功能也不相同[31]，如Kocuriapolaris具有異養氨氧化降解氮素的作用[32]，南極微球菌能產生低溫淀粉酶降解和轉化有機污染物[33]，克氏假單胞菌能增強擬南芥耐鹽性[34]，帶化紅球菌能通過影響植物細胞分裂素的代謝增強糖和氨基酸轉運蛋白和細胞壁轉化酶的表達[35]，約氏不動桿菌能夠對重要的環境污染物萘進行生物降解[36]，副凝聚短狀桿菌可以增強作物對鹽分脅迫的耐受性[37]，Serratiasurfactantfaciens能通過次級代謝產物對各種病原細菌和真菌產生強大的抗菌活性[38]，東洋芽孢桿菌通過增加對氧化應激的保護達到促進植物生長的作用[39]，嗜鹽假單胞菌能通過其分泌蛋白調控養分吸收和代謝[40]，這些種類細菌也在供試的4個馬鈴薯品種中被分離到。然而，本研究供試馬鈴薯葉片中的上述細菌在馬鈴薯生長發育及抗逆方面是否也具有類似功能，有待進一步研究驗證。

此外，本研究僅是對云南省4個主栽馬鈴薯品種合作88、會-2、麗薯6號和青薯9號薯塊發生期馬鈴薯葉片可培養內生細菌分離鑒定及其種類組成結構進行分析，而對于這些品種馬鈴薯塊莖中內生細菌組成結構同樣也值得研究，以弄清云南省4個主栽馬鈴薯品種內生細菌組成結構及多樣性，從而為系統研究馬鈴薯通過內生細菌介導其抗逆性及抗逆機理研究提供理論依據。

云南省4個主栽馬鈴薯品種青薯9號、會-2、合作88和麗薯6號葉片內生細菌豐富，各品種葉片內生細菌種類組成有明顯差異，每個品種均有其特有內生菌種類，但部分不同馬鈴薯品種間也存在相同菌屬和種類的內生細菌。該結果可為研究馬鈴薯內生菌多樣性及其抗蟲、抗病和抗旱等抗性功能內生菌篩選提供依據。