牦牛CEBPα基因克隆及在脂肪細胞中的表達模式

岳永起，華永琳，賈逸格，李 鍵，熊 燕，熊顯榮

(1.西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學 畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；3.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛生活在高寒低氧地區(qū)、具有重要文化和生產意義，被稱為高原上的生命之舟。牦牛肉營養(yǎng)價值豐富，是符合現代市場需求的綠色食品[1-2]。脂肪組織的生長發(fā)育是影響牦牛肉品質的關鍵因素之一。脂肪組織的沉積能力與脂肪細胞分化的過程密切相關，該過程是一個系統(tǒng)且復雜的過程，受多個轉錄因子相互協同作用[3]。

增強子結合蛋白α(CCAAT/Enhancer binding protein alpha，CEBPα)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族(增強子結合蛋白家族：CCAAT Enhancer binding protein，C/EBPs)中最早被發(fā)現的成員[4]。早期研究顯示，CEBPα基因在骨髓組織細胞分化和機體免疫等過程中發(fā)揮重要作用[5-7]。隨后有研究報道了CEBPα在脂肪細胞分化過程中的作用[8-9]，CEBPα受CEBPβ、KLFs家族等轉錄調控因子調控，同時它還可以調控PPARγ、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs)等來調控脂肪細胞的分化[3, 10]。牟彥雙等[11]通過添加油酸來探究雞前體脂肪細胞分化過程中CEBPα基因的表達，發(fā)現在脂肪細胞分化過程中表達較晚。張萌萌等[12]研究發(fā)現，CEBPα基因在牛肌內前體脂肪細胞分化早期開始表達，分化后期表達量明顯增加，說明CEBPα基因在不同物種脂肪細胞的表達模式存在差異。上述研究結果表明，CEBPα基因對于調控畜禽脂肪沉積有重要作用，但目前尚未有研究報道CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的作用。

因此，本試驗以牦牛為研究對象，克隆了牦牛CEBPα基因的整個CDS區(qū)并預測了蛋白結構和功能。通過qRT-PCR檢測了CEBPα基因在牦牛各組織中的表達及牦牛脂肪細胞中的表達模式，為深入研究CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的功能研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

試驗所用動物為4歲左右的金川公牦牛和麥洼公牦牛各4頭，均由四川阿壩羌族藏族自治州金川縣慶林鄉(xiāng)牦牛養(yǎng)殖場提供。采集牦牛的心、肝、脾、腎、胃、小腸、皮下脂肪、內臟脂肪和肌肉組織。采集的組織樣品用高溫滅菌的PBS清洗后，放入2 mL凍存管置于液氮罐帶回實驗室。采集的皮下脂肪組織用PBS清洗后，放入含有5×雙抗(PS)的DMEM培養(yǎng)基中，迅速帶回實驗室分離牦牛原代皮下脂肪細胞。

1.2 主要試劑

TRIzol購自成都擎科梓熙生物技術有限公司，PrimeScriptRTMaster Mix購自TaKaRa，SYBR Real-time PCR mixture試劑購自BioTeke，Gel Extraction Kit(100)膠回收試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)所用試劑耗材均購自成都鵬世達有限公司。氯仿、無水乙醇均為國產分析純，購自成都鵬世達有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

采用經典的膠原酶消化法分離牦牛原代皮下脂肪細胞。即將脂肪組織剪碎，加入適量1 mg/mL Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴鍋消化1 h，之后加入細胞培養(yǎng)液(含10%的FBS和1% PS的DMEM培養(yǎng)基)終止消化，1 700 r/min離心5 min，后將沉淀重懸，接種在10 cm培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天用PBS清洗2～3次，每2 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞融合至80%時誘導分化，收集0，3，6，9 d的細胞樣品用于提取RNA。

1.4 RNA提取及cDNA合成

使用TRIzol法提取組織和細胞樣品總RNA，RNA的質量和濃度通過核酸濃度測定儀進行評估，OD260/280在1.8～2.0被用于合成cDNA。按PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒的說明書合成cDNA。

1.5 引物設計

根據NCBI公布的牦牛預測序列(XM_005893918.2)設計基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設計引物，引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。引物信息見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.6 PCR擴增及克隆

以牦牛皮下脂肪的cDNA為模板，利用聚合酶鏈式反應進行目的基因的擴增。PCR反應體系如下：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板(1 000 ng/μL)1 μL，ddH2O 5.5 μL，PCR Mix 7.5 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。對PCR產物進行凝膠電泳。電泳完成后，將凝膠在紫外下照膠，將目的片段進行切割置于1.5 mL離心管中。參照膠回收試劑盒對目的片段進行膠回收?；厥债a物與pGM-T載體進行過夜連接，其中使用抗生素為氨芐(濃度100 mg/mL)。將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑選3個陽性菌落做菌液PCR。將陽性菌液送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行雙向測序。

1.7 實時熒光定量PCR

將反轉錄后的各組織和細胞樣品cDNA為模板，以PPIA為內參基因，檢測CEBPα的表達量。qRT-PCR反應體系15 μL：模板cDNA (100 ng/μL)3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。每個樣本重復3次。

1.8 Bodipy染色

收集誘導分化9 d的細胞樣品，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS洗3次，用終濃度2 μmol/L的Bodipy染色液染色30 min;PBS洗3次，加入DAPI染色10 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.9 生物信息學分析

根據獲得的牦牛CEBPα的CDS序列分別做以下幾個方面的生物信息學分析：①通過NCBI在線網站的 ORF Finder ( https：/ /www．ncbi．nlm．nih．gov /orffinder/) 尋找開放閱讀框，獲得氨基酸序列。②用DNAMAN軟件進行同源性比對，然后利用MEGA 5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。③ProtParam 軟件分析牦牛CEBPα蛋白的理化性質。④用ProtScale 軟件在線分析牦牛CEBPα蛋白的親疏水性。⑤用Tmpred、NetPhos 2.0 Server在線軟件分析CEBPΑ蛋白的跨膜結構和磷酸化位點。⑥用HNN和Phyre2在線軟件分析CEBPα蛋白的二級、三級結構。

1.10 數據分析

數據表示為平均值±標準誤。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行顯著性分析，其中每組數據3個重復(n=3)，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛CEBPα基因克隆及同源性分析

以牦牛皮下脂肪組織的cDNA為模板，利用PCR擴增獲得牦牛CEBPα基因全長為657 bp，與預測序列一致(圖1)。NCBI ORF Finder在線網站進行開放閱讀框分析，發(fā)現開放閱讀框大小為645 bp，編碼214個氨基酸。

圖1 牦牛CEBPα基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification products of CEBPα gene in yak

牦牛與大西洋鮭、普通牛、大鼠、雞、綿羊、小鼠、獼猴、人的CEBPα基因核苷酸和氨基酸序列進行同源比對(表2)?？芍笈Ｅc普通牛的核苷酸同源性最高，為99.73%，與大西洋鮭的核苷酸同源性最低，為73.86%；牦牛與小鼠和大鼠的氨基酸同源性相對較高，為100%，與普通牛的氨基酸同源性為99.19%，與大西洋鮭的氨基酸同源性低，為75.58%。以核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹，聚類結果表明(圖2)，牦牛與普通牛和綿羊親緣關系較近，與大西洋鮭的親緣關系最遠。

表2 牦牛CEBPα基因與其他已知物種的核苷酸、氨基酸序列對比結果Tab.2 Comparison results of nucleotide and amino acid sequences of CEBPα gene of yaks and other known species

圖2 牦牛與其他物種的CEBPα基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Genetic phylogenetic tree of CEBPα in yaks and other species

2.2 牦牛CEBPα蛋白結構及功能預測

牦牛CEBPα蛋白分子質量為23.267 73 ku，分子式為C1004H1574N302O325S6，氨基酸數為213，含19種氨基酸，其中Ala和Pro含量較高，所占比例分別為11.2%,9.8%，Cys含量較低，所占比例為0.9%(表3)。CEBPα蛋白理論等電點(pI)為5.59，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)為27，帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)為32。其在哺乳動物的尚未成熟的紅細胞中半衰期為30 h，不穩(wěn)性定指數(Ⅱ)為57.23，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂溶指數為57.57，親水性的平均值(GRAVY)為-0.844，為親水蛋白。

表3 牦牛CEBPα基因氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of CEBPα gene in yak

CEBPα蛋白 19個磷酸化位點，包括Ser(3、17、21、27、40、61、65、125、130、147、180、197)，Thr(158、166、185)，Tyr(7、67、106、208)，其中紅色、綠色、藍色分別代表絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點(圖3)。

圖3 牦牛CEBPα蛋白磷酸化位點分析Fig.3 The phosphorylation site analysis of yak CEBPα protein

CEBPα蛋白的二級結構主要為α螺旋(藍色)和無規(guī)則卷曲(紫色)，分別占27.10%，67.29%，β轉角和延伸鏈(紅色)占比為0和5.61%(圖4)。三級結構預測結果與二級結構一致(圖5)。

圖4 牦牛CEBPα蛋白二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of CEBPα protein in yaks

圖5 牦牛CEBPα蛋白三級結構預測Fig.5 Prediction of tertiary structure of CEBPα protein in yaks

2.3 牦牛CEBPα基因組織表達譜

以心為參照，通過qRT-PCR檢測牦牛組織中CEBPαmRNA的表達，結果表明，CEBPα在牦牛各組織中廣泛表達(圖6)，在皮下脂肪組織的表達顯著高于其他組織(P<0.05)，在腎、脾和內臟脂肪組織中表達量相對較低。

2.4 CEBPα在牦牛皮下脂肪細胞誘導分化過程中的表達

從牦牛皮下脂肪組織中分離得到的原代脂肪細胞進行誘導分化，觀察細胞形態(tài)的變化。分離得到的牦牛前體脂肪細胞類似于成纖維細胞，細胞形態(tài)呈梭形或三角形(圖7-A)。當細胞密度達到100%融合時進行誘導分化(圖7-B)。誘導分化9 d，細胞形態(tài)發(fā)生變化，由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)或圓形，細胞內充滿大量脂滴(圖7-C)。Bodipy染色結果表明(圖8)，分化9 d，有明顯的脂滴積累。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05) .

A.牦牛前體脂肪細胞(Preadipocyte，Pre)的形態(tài)；B.誘導分化第0天的細胞形態(tài)圖；C.誘導分化第9天的細胞形態(tài)圖。A.The morphology of yak preadipocytes (Preadipocyte, Pre)；B.The morphology of cells at day 0 of induced differentiation；C.The morphology of cells on the 9th day of induced differentiation.

圖8 Bodipy染色(100×)Fig.8 Bodipy stain (100×)

在誘導分化第0，3，6，9天收集牦牛脂肪細胞樣品，采用qPCR技術對CEBPαmRNA的表達量進行相對定量分析(圖9)。研究結果表明，CEBPα在分化的第3，6，9天與第 0 天相比，均極顯著上升(P<0.01)，在分化過程中呈現上升的趨勢。

3 討論與結論

研究表明，在構建體外培養(yǎng)的牛成肌細胞體系中，CEBPα能誘導成肌細胞向脂肪細胞轉化[13]。在牛肌肉的干細胞(MSCs)中過表達CEBPα能誘導LPL、PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ基因的表達，表明CEBPα基因在脂肪細胞分化過程可能具有重要作用[14]。此外Wang等[15]研究指出，牛CEBPα基因可以調控ABHD5基因(alpha/beta hydrolase 5，ABHD5)，間接調控細胞脂質代謝。因此，本研究采用金川牦牛和麥洼牦牛為研究對象，獲得牦牛CEBPα的基因序列及其在牦牛脂肪組織中的表達特性，為后續(xù)研究CEBPα基因對牦牛脂肪沉積的具體作用機制提供了依據和參考。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。The different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01) .

通過PCR成功獲得牦牛CEBPα基因，其CDS區(qū)全長645 bp，編碼214個氨基酸，該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。同源性分析結果表明，牦牛CEBPα基因與普通牛的同源性相對較高，核酸同源性為99.73%，氨基酸同源性為99.19%，構建系統(tǒng)進化樹的結果顯示，牦牛與普通牛和綿羊的相似性較高。系統(tǒng)發(fā)育樹與同源性比對結果一致，說明CEBPα基因的編碼區(qū)在進化過程中相對保守。

組織表達結果發(fā)現，CEBPα在牦牛不同組織中均有表達，其中皮下脂肪表達水平最高，內臟脂肪表達量最低。說明CEBPα可能在調控牦牛皮下脂肪的發(fā)育中具有重要作用。有研究報道，CEBPα在小鼠脂肪組織、肺、胎盤和肝臟中高表達[15-16]。池永東等[17]研究發(fā)現，CEBPα在皮下脂肪組織中表達量最高，這與本研究的結果相一致，推測該基因可能在反芻動物中相對保守，在其他物種中存在物種特異性。

分離到的牦牛皮下脂肪細胞呈梭形或三角形，在經過誘導成脂，細胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)或圓形，并伴隨著脂滴的產生和積聚。劉敏等[18]分離得到豬皮下前體脂肪細胞，細胞形態(tài)呈不規(guī)則梭形。這與本試驗分離的得到的前體脂肪細胞形態(tài)相一致。表明成功分離了牦牛前提脂肪細胞。CEBPα在牦牛脂肪細胞分化過程中隨著分化的進行，其表達量逐漸上升。筆者推測CEBPα可能在牦牛脂肪細胞分化早期發(fā)揮作用。有研究報道，在3T3-L1脂肪細胞中，CEBPα的表達量隨著分化的進行，表達量逐漸升高，在第6天達到頂峰[19]。這與筆者的研究結果相一致。王家麒等[20]研究表明,在綿羊前體脂肪細胞中。隨著誘導分化的進行CEBPα表達量呈現先上升后下降。這與筆者的研究結果存在差異，推測其可能的原因，是由于物種之間的差異造成的。

本研究克隆了牦牛的CEBPα基因，其CDS區(qū)全長645 bp，編碼214個氨基酸，該蛋白的不穩(wěn)定系數為57.23，表明該蛋白具有不穩(wěn)定性，親水性占比大于疏水性，為親水性蛋白。CEBPα在皮下脂肪組織中高表達，在內臟脂肪組織中低表達。在牦牛前體脂肪細胞誘導分化過程中，其表達量逐漸升高。以上結果為牦牛CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的功能研究提供基礎數據。