自身抗體分析的方法學(xué)比較及臨床意義

謝劍波，王光彥，鄭國燕，車銀芹

云南省楚雄州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （云南大姚 675000）

自身免疫性疾病是一種由機(jī)體自身免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的對器官和組織進(jìn)行攻擊的疾病，是一類包含了至少80種疾病的家族[1]。臨床認(rèn)為，該類疾病相對不常見，通常人群總體患病率為 3%～5%，但患病后的治療及預(yù)后對患者生命質(zhì)量影響較大[2]。目前，臨床針對該類疾病的診斷與治療已有了極大的進(jìn)步，但關(guān)于病因?qū)W方面的研究仍較少。抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）是一組攻擊細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)的自身抗體，血清ANA 陽性常提示可能存在自身免疫性疾病[3]，如系統(tǒng)性自身免疫性疾病[系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、藥物性狼瘡、硬皮病、干燥綜合征（Sjogren syndrome，SS）、混合性結(jié)締組織病（mixed connective tissue disease，MCTD）、多肌炎（polymyositis，PM）/皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、少關(guān)節(jié)型幼年慢性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎]或器官特異性自身免疫性疾病[Graves 病、橋本甲狀腺炎、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH ）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、炎癥性腸病或特發(fā)性肺纖維化][4-7]。血清ANA 是目前臨床診斷自身免疫性疾病的主要指標(biāo)，但檢測方法、試劑、儀器的不同均會對結(jié)果造成一定的影響。目前，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室檢測血清ANA 普遍采用定性方法（間接免疫熒光+免疫印跡）[8]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，自動化檢測逐漸成為一種趨勢。基于此，本研究比較免疫印跡法（定性方法）和化學(xué)發(fā)光法（定量方法）對ANA 譜的檢測陽性率，并分析兩種方法對ANA譜檢測結(jié)果的一致性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月于云南省楚雄州人民醫(yī)院確診的70例自身免疫性疾病患者，其中男12例，女58例；平均年齡（36.1±20.9）歲；疾病類型，SLE 28例，SS 17例，RA 11例，MCTD 8例，AIH 6例（各疾病診斷均按照相關(guān)臨床指南規(guī)定方式確診）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

采集患者空腹肘靜脈血4 ml，以4 000 r/min 離心10 min，取血清，并將其置于-80 ℃下保存待檢；采用歐蒙抗核抗體譜（IgG）檢測試劑盒（免疫印跡法）、北京中航賽維VI-180全自動化學(xué)發(fā)光儀（采用基于二氧雜環(huán)乙烷化合物和堿性磷酸酶的間接化學(xué)發(fā)光法，與儀器配套的檢測試劑共同使用）對同一患者的血清進(jìn)行平行對照試驗(yàn)，兩種方法檢測項(xiàng)目相同，均包括抗雙鏈（dsDNA）抗體、抗U1小核糖核蛋白（nRNP/Sm）抗體、抗史密斯（Sm）抗體、抗干燥綜合征A（SS-A）抗體、抗干燥綜合征B（SS-B）抗體、抗硬皮病70蛋白（Sc1-70）抗體、抗多肌炎-硬皮病（PM-Scl）抗體、抗合成酶（Jo-1）抗體、抗著絲點(diǎn)（Centromeres）抗體、抗核小體（Nucleosomes）抗體、抗組蛋白（Histones）抗體、抗核糖體P蛋白（Rib-P）抗體、抗2-酮酸脫氫酶復(fù)合物（M2-3E）抗體、抗增殖型細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、抗Ro-52抗體，檢測時(shí)由同一操作人員嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書執(zhí)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩種方法對ANA 譜的檢測陽性率，檢測陽性率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%；計(jì)算化學(xué)發(fā)光法的陽性符合率和總符合率，陽性符合率=兩種方法均為陽性例數(shù)/免疫印跡法陽性例數(shù)×100%，總符合率=兩種方法均為陽性例數(shù)/兩種方法均為陰性例數(shù)×100%；分析兩種方法對ANA 譜檢測結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；一致性采用Kappa分析，Kappa<0.2表示一致性差，0.2≤Kappa<0.4表示一致性一般，0.4≤Kappa<0.6表示一致性中等，0.6≤Kappa<0.8表示一致性較好，0.8≤Kappa≤1表示一致性好[9]。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對ANA 譜的檢測陽性率比較

在ANA 譜的檢測中，免疫印跡法對抗Jo-1抗體及抗PCNA 抗體的檢測陽性率均為0，而化學(xué)發(fā)光法僅對抗PCNA 抗體的檢測陽性率為0；兩種方法對15項(xiàng)檢測項(xiàng)目的檢測陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩種方法對ANA 譜的檢測陽性率比較[例（%），70例]

2.2 兩種方法對ANA 譜檢測結(jié)果的一致性分析

在ANA 譜的檢測中，兩種方法對15項(xiàng)檢測項(xiàng)目的陽性符合率為0～100.00%，總符合率為86.96%～100.00%；兩種方法除對抗Scl-70抗體、抗Histones 抗體、抗Rib-P 抗體3項(xiàng)檢測項(xiàng)目的一致性一般外，對其他檢測項(xiàng)目的一致性較好，見表2。

表2 兩種方法對ANA 譜檢測結(jié)果的一致性分析

3 討論

臨床認(rèn)為，自身免疫性疾病是一種由功能失調(diào)的免疫激活導(dǎo)致的以細(xì)胞或器官特異性自身抗原為靶點(diǎn)的病理性免疫反應(yīng)[10]。其中，關(guān)于SLE 的流行病學(xué)研究表明，SLE的全球發(fā)病率和流行率呈不斷升高的趨勢[11]。對于多種自身免疫性疾病，臨床尚不清楚其病因，許多因素，如遺傳、微生物群和環(huán)境毒素均可影響或誘導(dǎo)自身免疫，最終導(dǎo)致全身器官疾病[12-14]。所有自身免疫性疾病都是由先天和獲得性免疫反應(yīng)驅(qū)動的，對于疾病的特異性，常通過 IgG 自身抗體的存在來定義[15]。臨床通常會在自身免疫性疾病患者的血清中發(fā)現(xiàn)大量自身抗體[16]，盡管這些抗體在疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中發(fā)揮了作用，但其直接作用從未被闡明，但一些自身抗體可以預(yù)測無癥狀受試者的疾病進(jìn)展，因此，自身抗體檢測常被用于自身免疫性疾病的診斷和療效觀察中。

以往國內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室采用免疫印跡法檢測ANA 譜，該方法為定性檢測，檢測項(xiàng)目固定，且只能批量檢測，難以實(shí)現(xiàn)隨機(jī)上樣，限制了ANA 譜檢測的應(yīng)用范圍[17]。近年來，隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，全自動化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)因具有自動、定量、隨機(jī)上樣、檢測線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于臨床樣品檢測中。本研究結(jié)果顯示，在ANA 譜的檢測中，兩種方法對15項(xiàng)檢測項(xiàng)目的檢測陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明兩種方法具有一致性；兩種方法除對抗Scl-70抗體、抗Histones 抗體、抗Rib-P 抗體3項(xiàng)檢測項(xiàng)目的一致性一般外，對其他檢測項(xiàng)目的一致性較好。經(jīng)分析，兩種方法對抗Scl-70抗體、抗Histones 抗體和抗Rib-P 抗體的一致性一般的原因可能為：免疫印跡法利用的是抗原抗體原理進(jìn)行電轉(zhuǎn)移印斑法檢測，而化學(xué)發(fā)光法雖利用的是相同的原理，但經(jīng)過了生物素-親和素的放大系統(tǒng)后，檢測靈敏度明顯提高；免疫印跡法的反應(yīng)體系為固相醋酸膜，可能會發(fā)生抗原抗體結(jié)合不充分，而化學(xué)發(fā)光法采用均一液相體系且儀器操作，能夠保證更好的反應(yīng)操作效率；抗體自身的陽性率也會對結(jié)果造成一定的影響，抗Sc1-70抗體見于25%～75%的進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）患者中，抗Rib-P 抗體陽性率為5%～15%，抗Histones 抗體在SLE 患者中的檢出率為15.7%[18-21]，這些抗體能夠檢出的概率較低，導(dǎo)致檢測時(shí)需要多次反復(fù)檢測才能檢出，因此會對方法一致性驗(yàn)證造成一定影響。

綜上所述，化學(xué)發(fā)光法與免疫印跡法檢測ANA 譜的結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，總符合率高，一致性評價(jià)優(yōu)異。