雞Lats1基因在卵泡不同發育期的半定量表達研究

呂智超，李 旭，武 斌，徐日福，張云影*

1.吉林省經濟管理干部學院，吉林長春 130000；2.吉林省農業科學院，吉林長春 130033；3.吉林農業大學動物科技學院，吉林長春 130118

本實驗以150日齡的海蘭褐蛋雞為試驗材料，采用半定量RT-PCR方法檢測海蘭褐蛋雞不同等級卵泡發育時期Lats1基因的mRNA表達水平，實驗結果得出Lats1基因存在于海蘭褐蛋雞卵泡發育各個時期，并呈現一定表達規律，說明Lats1基因參與家禽開產時卵泡發育的調控，有促進細胞生長的作用。本實驗為進一步研究Hippo信號通路在雞卵泡不同發育時期控制細胞增殖時空表達模式打下基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇150日齡海藍褐蛋雞40只，在相同的環境下飼養。在4 ℃低溫條件下，快速分離直徑為1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm和F6-F1的卵泡組織，放于液氮中速凍保存。

1.2 實驗試劑與儀器

微量RNA提取試劑盒(W6221)購自上海華舜公司，TU-1901紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司，凝膠成像系統購自上海復日科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成

根據GenBank中的雞Lats1基因mRNA序列（XM_419666.3）和GAPDH基因mRNA序列(K01458)的mRNA為模板，設計半定量實驗的引物如表1。所有引物運用Premier 5.0和Oligo 7.0軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。

表1 引物設計及擴增產物長度

2 實驗方法

2.1 RNA抽提

取新鮮組織100 mg加1 mL TotalRNAExtractor充分研磨，將所得到的RNA溶液一部分用于后續試驗，一部分置于-70 ℃保存。

2.2 反轉錄成cDNA

在0.2 mLPCR管中加4 μL Rnase-free ddH20,1 μL Random Primer p(dN)6（0.2 μg/ μL），70 ℃溫浴5 min，冰浴10 sec。利用離心機離心，然后加入下列試劑：1.0 μL Rnase inhibitor（20 U/ μL），2.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L），4.0 μL 5×Reaction Buffer，2.0 μL AMV Reverse Transcriptase（10 U/μL）。37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min，-20 ℃保存。

2.3 半定量RT-PCR反應步驟

半定量RT-PCR反應體系（25 μL）：RNasefree Water11 μL，2×Tag MasterMix12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA0.5 μL。半定量PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s（35個循環），終延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

2.4 半定量RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

Lats1基因與GAPDH基因用2%的瓊脂糖凝膠按1:1的比例，130 V恒壓電泳30 min。然后利用凝膠成像系統對電泳后的凝膠拍照，凝膠圖片會顯示Lats1基因與GAPDH基因的灰度值，通過ImageJ2x、BandScan5.0軟件進行灰度分析，測三次，求平均值。Lats1基因與GAPDH基因灰度值的比值即Lats1基因mRNA的相對表達量。再通過獨立樣本T檢驗和單因素方差（SPSS 18.0軟件）對各組數據進行差異顯著性分析。

3 半定量RT-PCR實驗結果與分析

3.1 電泳檢測結果

用游標卡尺將海藍褐蛋雞的卵巢按直徑大小分為間質、等級前卵泡（1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm）和F1～F6等級卵泡。提取150 d海藍褐卵巢的12個組織的總RNA，根據目的基因片段的大小配置1.5%濃度的瓊脂糖凝膠，將PCR擴增產物與微量溴酚藍混合，1×TAE電泳緩沖液下，在含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過凝膠電泳成像系統拍照，經觀察，能夠清楚的看見28 S、18 S和5 S三條帶，其中28 S的亮度是18 S的兩倍，而5 S是最不亮的。表明提取的總RNA降解少，完整性高。通過核酸蛋白測定儀測定，OD260/OD280值（吸光度值）在1.8～2.2之間，表明此RNA的純度較高。

3.2 Lats1在海藍褐組織中的表達情況

定性PCR檢測了基因Lats1在海藍褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中的表達情況。基因均有表達且表達特異，無引物二聚體和拖尾現象，基因引物特異性強，可用于后續試驗。

3.3 Lats1基因mRNA在海蘭褐蛋雞不同等級卵泡中的半定量RT-PCR檢測結果

以GAPDH為內標基因，Lats1基因為目的基因。利用半定量RT-PCR檢測基因在150日齡海蘭褐蛋雞卵巢間質、1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm、F6、F5、F4、F3、F2和F1共12個卵巢組織中的相對表達量，如表2所示。

從表2看出，在150日齡的海藍褐蛋雞各等級卵泡內均檢測有Lats1基因表達，但在不同直徑大小卵泡中的表達豐度有一定的差異。5～5.9 mm卵泡組織中的表達豐度最高，為0.1970；在6～6.9 mm、F5、4～4.9 mm、F3、7～8 mm和間質的相對表達量次之；在F6的表達水平最低，為0.1045。5～5.9 mm與1～3.9 mm、F4、F6、F1、F2之間差異顯著（p＜0.05），6～6.9 mm與1～3.9 mm、F6、F4之間差異顯著（p＜0.05），其余的卵泡之間相對表達量差異不顯著（p＞0.05）。Lats1基因mRNA在海藍褐蛋雞各個等級卵泡中，表達量各不相同，在前等級卵泡中的表達量整體高于等級卵泡的表達量，前等級卵泡中表達量呈先上升后下降的趨勢，并在5～6 mm處表達量最高，在等級卵泡中F5表達量最高，F3次之，但整體呈現基本平穩的狀態。

表 2 Lats1基因相對表達量

4 討論

RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是一種常規的、常見的檢測基因的方法，它具有較高的靈敏度和特異性。定量PCR對實驗儀器和樣本處理的要求都比較高，所以結果相對半定量而言會更加精準[1]。但是熒光定量PCR相對成本高，對于一些條件設施不完善的工作平臺，選擇一種方法，能夠替代熒光定量PCR，且結果一致，是有實際利益的。

研究發現，Hippo信號通路是通過調節下游基因的表達，將細胞信號從細胞質傳遞到細胞核，從而對細胞的生長、增殖和凋亡進行一個整體調控，而且，Hippo信號通路還參與器官大小和組織再生的調控，并在胚胎發育等過程中發揮重要作用。本實驗選取的基因Lats1是Hippo信號通路主要基因在家禽的同源基因，為了驗證它們是否是家禽體內Hippo信號通路的作用基因，首先我們采用定性PCR方法，驗證選取的基因是否存在家禽組織內，再采用半定量RT-PCR方法對基因定量。分析本實驗結果顯示，Lats1在蛋雞卵巢組織及各個等級卵泡中均有表達，說明Lats1基因參與了卵泡從開產到產蛋高峰的整個過程，前等級卵泡的整體表達水平略高于等級卵泡的表達水平，在前等級卵泡中表達量先升高后降低，在等級卵泡中，表達量基本穩定，說明Lats1基因參與家禽開產時卵泡發育的調控，也有促進細胞生長的作用。

5 小結

本文根據目的基因Lats1和內參基因在Genebank上已知序列設計引物，對基因進行體系優化及程序優化。主要結果如下：通過定性PCR實驗得出：Lats1在海藍褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中均有表達且表達特異，無引物二聚體和拖尾現象。基因的引物特異性強，可用于后續試驗。說明Lats1基因存在于家禽中大部分的組織器官。

通過半定量RT-PCR實驗得出：Lats1在海藍褐蛋雞的卵巢間質及各個等級卵泡中均有表達，表達量存在一定規律，前等級卵泡的表達量均大于等級卵泡中的表達量。說明Lats1基因參與家禽開產時卵泡發育的調控，有促進細胞生長的作用。