預防性霧化吸入依達拉奉對吸入性損傷大鼠肺功能的影響

肖長栓 劉婭平 楊景哲 于 躍

吸入性損傷是呼吸道及肺實質共同損傷的燒傷危急重癥，其致傷原因多為煙霧和/或熱力，是目前燒傷患者死亡的重要原因之一。吸入性損傷發生后，熱力可直接損傷呼吸道及肺組織，而煙霧中所含有的多種毒性物質被呼吸道黏膜吸收后可啟動一系列失控性炎癥反應，產生大量氧自由基，甚至可造成系統性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome SIRS)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODF)；因其發病隱匿、癥狀不典型，診斷及治療常滯后，往往導致嚴重后果，如何在早期使用有效手段適當干預一直是國內外研究的熱點。依達拉奉具有抑制脂質過氧化的作用，作為一種新型的氧自由基清除劑，在臨床上多用于神經系統疾病的治療，起到抑制神經細胞凋亡，減輕腦細胞胞膜過氧化的作用。另有動物研究表明，腹腔注射依達拉奉對煙霧吸入性肺損傷具有保護作用，其機制可能與抑制自由基及炎癥介質的產生和釋放有關。依達拉奉具有分子質量小、脂溶性高的特點，可輕易穿過生物膜，霧化吸入的給藥方式可將藥物局限在靶器官并獲得穩定的組織內藥物濃度，可能更有利于肺組織的保護，但其作用機制和治療效果尚未明了。本實驗擬通過霧化吸入依達拉奉對煙霧吸入性損傷大鼠模型進行干預，比較預防性給藥及延長藥物作用時間對該模型的肺保護作用，并探討其可能機制，以期為臨床提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30只雄性SD大鼠，60～70日齡，體質量約200 g，購自中國食品藥品檢定研究院[動物生產許可證號：SCXK(京)2017-0005]，購入后適應性飼養1周，室溫維持在22～25℃，自由飲食。實驗開始前12 h禁食，自由飲水。

1.1.2 主要試劑 依達拉奉原料藥(批號：19042011，純度：99.7%)購自雙鶴藥業(商丘)有限責任公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α；批號：20180401)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6；批號：20180505)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10；批號：20180308)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA；批號：20180305)試劑盒購自美國R&D公司，大鼠肺髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO；批號：20171214)、丙二醛(malondialdehyde，MDA；批號：20171213)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD；批號：20171212)、考馬斯蛋白(批號：20171224)檢測試劑盒購自南京建成公司，TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒(批號：20171020)購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.1.3 儀器 ELX800UV酶標檢測儀(美國BioTek公司)，CK40型光學顯微鏡(日本Olympus公司)，Centrifuge5702離心機(EPPENDORF公司)，LEICA石蠟切片機，ABL-800血氣分析儀(丹麥雷度公司)，PARI BOY N 系列霧化機(德國百瑞有限公司)，KD-BM生物組織包埋機(浙江科迪儀器設備公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 雄性SD大鼠30只，采用隨機數字表法分為5組，正常對照組(A組)、生理鹽水組(B組)、依達拉奉6 h治療組(C組)、依達拉奉24 h治療組(D組)、依達拉奉預防組(E組),每組6只。參照相關文獻[6]，提前在煙霧發生器內放入松木屑，打開電爐電源，發煙15 min，打開致傷室進氣口閥門和風扇，當報警器報警后關閉閥門；各組大鼠腹腔注射100 mg/kg鹽酸氯胺酮麻醉，E組大鼠置于自制密閉玻璃箱中，用霧化機以0.1 mL/min的射流速度霧化吸入1.8 mg/mL依達拉奉(溶媒為生理鹽水)10 min后，將B～E組大鼠放入致傷室下層，拉開致傷室中間開槽式拉板，將大鼠致傷5 min，關閉開槽式拉板，取出大鼠將其置于室內空氣流通區5 min，反復操作3次，致傷過程約30 min，每次致傷6只大鼠；A組不放發煙木屑，其他步驟與B～E組相同。模型制作成功后30 min，按照E組致傷前所用霧化吸入法給予B組霧化吸入生理鹽水，C、D組霧化吸入1.8 mg/mL依達拉奉(溶媒為生理鹽水)各10 min，間隔1 h重復1次，共4次；給予E組霧化吸入1.8 mg/mL依達拉奉(溶媒為生理鹽水)10 min，間隔1 h重復1次，共3次；A組不吸入任何藥物，余步驟相同。模型制作及給藥過程中無大鼠死亡等意外情況發生。

1.2.2 標本采集 在致傷后6 h， A、B、C、E組以血氣針抽取頸動脈血1 mL后待血氣分析；開腹留取腹主動脈血約5 mL，3 000 r/min速度離心15 min后留取上清液，-20℃冷凍保存待測IL-6、IL-10、TNF-α；處死動物，迅速取出肺組織，選擇左肺組織及時保存于-70℃冰箱中待測Caspase-3、MDA、MPO、SOD；選擇右肺后葉經4%的甲醛固定24 h，留待病理檢查及TUNEL法檢測；選擇右肺組織前葉及中葉待測肺組織含水率及濕干比。在致傷后24 h，D組進行標本采集，操作方法及步驟與其他各組相同。

1.2.3 指標檢測及方法

1.2.3.1 氧合指數、肺組織含水率及濕干比測定 將血標本在30 min內用血氣分析儀行動脈血氣分析，計算氧合指數(PaO/FiO)；處死動物取肺組織標本后立即用濾紙拭干組織表面液體，電子天平準確稱濕重并記錄，隨后放入恒溫電烤箱中以80℃烘烤48 h，電子天平稱干重并記錄數值。兩者之間比值為肺濕干比(

W/D

)；含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3.2 血清IL-6、IL-10、TNF-α測定 解凍血清標本，采用ELISA法按照試劑盒說明書操作，以酶標儀于450 nm波長處讀取各管吸光度(OD值)，根據標準曲線方程及OD值計算樣品中IL-6、IL-10、TNF-α含量。均以pg/mL為單位。

1.2.3.3 肺組織Caspase-3、MDA、MPO、SOD測定 解凍組織標本，用濾紙吸干表面液體及污物，快速剪碎并充分研磨，按質量體積比1∶9加入冷生理鹽水，制備組織勻漿。采用考馬斯亮藍蛋白測定法測定肺組織勻漿液中蛋白濃度。分別采用鄰聯茴香胺供氫法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法、ELISA法嚴格按照各試劑盒說明書操作，以酶標儀于460 nm、532 nm、550 nm、450 nm波長處測定各管OD值，根據標準曲線方程及OD值計算組織中MPO、MDA、SOD、Caspase-3含量(分別以U/mg、U/g、nmol/mg、μmol/mL為單位)。

1.2.3.4 制作肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色切片 取固定好的右肺后葉組織適量，依次進行脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色后光鏡下觀察。

1.2.3.5 肺組織細胞凋亡率 采用TUNEL方法分析肺組織細胞凋亡。取適量固定好的適量右肺后葉組織脫水、包埋并切片，行TUNEL染色，按照TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒說明書操作，凋亡細胞用熒光顯微鏡可觀察到熒光增強。每只大鼠隨機選取5個非重疊高倍鏡視野(×400)，計數凋亡細胞數和細胞總數，肺組織細胞凋亡率=凋亡肺組織細胞數/肺組織細胞總數×100%。

1.3 觀察指標 ①觀察5組大鼠肺組織病理變化情況；②記錄并比較5組大鼠PaO/FiO、肺組織含水率、

W/D

、肺組織細胞凋亡率的變化；③記錄并比較5組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10及肺組織均漿中Caspase-3、MDA、MPO、SOD水平的變化。

2 結果

2.1 5組大鼠肺組織病理切片結果比較 光學顯微鏡下觀察，A組肺泡腔結構清晰，腔內無炎性細胞浸潤，肺泡壁光滑且厚度均勻(見圖1A)；B組肺泡結構混亂，呈現不同程度的擴張或萎縮，腔內有大量紅細胞及炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚明顯(見圖1B)；C組肺泡大小、形態尚不規則，可見一定程度的擴張或萎縮，肺泡腔仍內尚可見一定數量的炎性細胞浸潤，但其浸潤程度輕于B組(見圖1C)；D組肺泡大小較一致，形態較規則，腔內紅、白細胞浸潤程度輕于C組(見圖1D)；E組肺泡結構、大小及形態改善最明顯，肺泡腔內炎癥及紅細胞浸潤程度最輕(見圖1E)。

圖1各組大鼠肺組織切片的顯微圖(HE×400)

2.2 5組大鼠PaO/FiO、肺組織含水率及

W/D

比較 各組大鼠PaO/FiO、肺組織含水率及

W/D

比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。與A組相比，B、C、D、E組PaO/FiO降低(

P

<0.05)，肺含水率、

W/D

升高(

P

<0.05)；與B組比較，C、D、E組PaO/FiO升高，升高程度E組>D組>C組(

P

<0.05)，差異均有統計學意義；肺含水率、

W/D

顯著降低，降低程度E組>D組>C組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠PaO2/FiO2、肺組織含水率及W/D比較

2.3 5組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-10水平的比較 各組大鼠TNF-α、IL-6及IL-10比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。與A組相比，B、C、D、E組TNF-α、IL-6及IL-10水平升高(

P

<0.05)；與B組比較，C、D、E組IL-10水平升高，升高程度E組>D組>C組(

P

<0.05)，差異均有統計學意義；TNF-α、IL-6水平顯著降低，降低程度E組>D組>C組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

2.4 5組大鼠肺組織MDA、MPO及SOD水平的比較 各組大鼠MDA、MPO及SOD比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。與A組相比，B、C、D、E組MDA、MPO水平明顯升高(

P

<0.05)，SOD水平明顯降低(

P

<0.05)；與B組比較，C、D、E組SOD水平明顯升高，升高程度E組>D組>C組(

P

<0.05)，差異均有統計學意義；MDA、MPO水平降低，降低程度E組>D組>C組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表3。2.5 5組大鼠肺組織細胞凋亡率及Caspase-3含量比較 各組大鼠肺組織細胞凋亡率及Caspase-3比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。與A組相比，B、C、D、E組肺組織細胞凋亡率及Caspase-3含量明顯升高(

P

<0.05)；與B組比較，C、D、E組肺組織細胞凋亡率及Caspase-3含量顯著降低，降低程度E組>D組>C組差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表4。

表3 5組大鼠肺組織MDA、MPO、SOD水平比較

表4 5組大鼠肺組織細胞凋亡率及Caspase-3含量比較

3 討論

目前研究表明，吸入性損傷后吸入的有毒及高熱氣體可誘導級聯式炎癥反應，釋放大量炎癥介質、細胞因子及氧自由基，促進肺細胞凋亡。自由基如OH、ONOO可通過硝化/亞硝化及過氧化反應損傷肺組織蛋白質、脂質及DNA，使肺內皮細胞間鏈接斷裂，破壞上皮細胞的完整性。依達拉奉可通過電子轉移作用清除自由基從而達到抗氧化的目的。有研究表明，依達拉奉可抑制神經細胞凋亡而對創傷后顱腦具有明顯的保護作用。在海水淹溺導致的急性肺損傷中，依達拉奉可通過抑制炎癥介質控制肺損傷的發展。因炎癥反應、過氧化、細胞凋亡在吸入性損傷過程中均扮演重要角色，故筆者推測依達拉奉對煙霧吸入性損傷可能具有積極的肺保護作用。有資料證明，對肺損傷應用依達拉奉預處理，所獲得的實驗結果可靠、具有說服力；根據預實驗結果，實驗動物未觀察到過敏癥、肝腎損傷、死亡等藥物毒副作用。另外，霧化吸入法可通過提高靶器官中藥物濃度發揮出最大程度的藥物治療作用。因同類研究少有選擇預給藥及霧化吸入法，故筆者采用預吸入依達拉奉大鼠探討對肺損傷的影響。

肺損傷后炎癥細胞活化、內皮細胞破壞導致肺血管阻力升高，肺順應性及氧合能力降低。重度燙傷大鼠應用依達拉奉可顯著改善肺水腫及低氧合。肺組織含水率、

W/D

及氧合指數是常用的考量肺組織炎癥反應后肺水腫及肺微血管損傷情況的指標。吸入性損傷大鼠腹腔注射依達拉奉，可減輕肺水腫程度并提高動脈氧分壓。本實驗結果表明，C、D、E組較B組肺含水率及

W/D

降低、PaO/FiO升高，其中E組變化最明顯；病理切片顯示，致傷各組大鼠肺泡形態各異，有一定數量炎癥細胞浸潤、轉移，提示煙霧吸入性損傷模型制作成功，其中炎癥細胞減輕程度E組>D組>C組>B組，說明霧化吸入依達拉奉可改善肺水腫及氧合情況、減輕炎癥反應，并有時效性，且早應用效果好，但具體作用機制需進一步研究。

吸入性損傷后大量巨噬細胞產生及釋放TNF-α等大量促炎因子，啟動局部或全身炎癥反應。TNF-α可活化血液中多形核白細胞、動員骨髓白細胞并促進細胞間黏附分子、E選擇素活化，上調IL-1、IL-6等細胞因子水平。IL-6可繼續上調其他細胞因子水平，形成細胞網絡，放大并延續級聯式炎癥反應。研究表明，IL-6、IL-1β、TNF-α可阻礙肺組織灌注及充分氧合，致使血管通透性升高，導致并加重肺水腫與氣道梗阻。TNF-α、IL-6能較好的反映肺組織的損傷程度，提示多臟器功能障礙，是肺損傷治療效果的可靠指標。同時，機體通過釋放IL-10抑制多形核白細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-8減輕細胞損傷，起到器官組織的保護作用。故IL-10的水平可間接反映機體抗炎能力。本研究結果表明，C、D、E組與B組比較，血清IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，且此變化E組>D組>C組，提示對于煙霧吸入性損傷，霧化吸入依達拉奉具有顯著的抗炎作用，并存在時效關系，且預防性用藥效果更明顯。

SOD能抑制化學趨向性因子，切斷炎癥反應通路，是反映機體抗氧化能力的重要指標；炎癥反應產生大量彈性蛋白酶及MPO，通過檢測MPO水平可反映組織中炎癥細胞的浸潤程度；通過檢測脂質過氧化反應中產物MDA可反映機體氧自由基水平。本實驗表明，B組氧化/抗氧化平衡被破壞，C、D、E組較B組MPO、MDA水平降低，呈遞減趨勢，SOD升高，呈遞增趨勢，提示對于煙霧吸入性損傷，依達拉奉的抗氧化作用具有一定的時效性，且預防性藥效更明顯。

有研究顯示，依達拉奉可通過影響Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達有效抑制大鼠肺細胞凋亡。其中Caspase-3是重要的凋亡執行因子，由吸入性損傷后線粒體所釋放的細胞色素C活化，標志著細胞凋亡進入不可逆階段。本研究結果表明，致傷各組肺組織細胞凋亡率及Caspase-3水平均較空白組升高，依達拉奉干預后，上述指標降低程度E組>D組>C組，說明霧化吸入依達拉奉可減輕吸入性損傷肺細胞凋亡程度，并有時效關系，且預防性用藥效果更好。

綜上所述，霧化吸入依達拉奉可能通過減少炎癥介質及氧自由基的產生及釋放、抑制細胞凋亡對煙霧吸入性肺損傷起保護作用，并存在一定的時效關系，且適當時機的預防性干預治療效果更佳。