ApoE基因多態性與冠心病病變范圍及氯呲格雷抵抗的關系

王亞丹 鄭穎穎 艾景雪 李運麗 高 瑞

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)是以冠狀動脈粥樣硬化為基礎病理特征的常見慢性病，其發病可受多種病因及誘因影響，其中血脂異常被認為是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，與冠心病發生發展關系密切。載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)作為血漿脂蛋白重要組成部分，參與脂質轉運及代謝，對維持血脂平衡十分重要。人體編碼ApoE基因位于第19號染色體，有ε2、ε3、ε4三種共顯性等位基因，共構成ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4 6種基因型，ApoE基因表達不同可影響ApoE結構及功能，繼而影響脂質代謝。明確ApoE基因多態性與冠心病關系是臨床研究熱點，其結果或可為冠心病易感人群診斷、預防提供依據。

經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention,PCI)是疏通狹窄或閉塞冠狀動脈管腔、改善心肌灌注的技術，已成為冠心病重要治療手段。氯吡格雷作為抗血小板治療的重要藥物，在心腦血管疾病二級預防中有廣泛應用，也是目前預防PCI術后血栓事件的常用藥物之一。但因個體差異，不同人對藥物反應性不一，部分患者應用氯吡格雷時，可表現出藥物對血小板聚集抑制率下降情況，即使規范用藥仍達不到預期效果，這一現象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR)。若能早期預測冠心病患者CR風險，則可為臨床PCI術后個性化用藥提供參考。基于上述背景，本研究探究了ApoE基因多態性與冠心病患者病變范圍及PCI術后氯吡格雷抵抗關系，旨在為臨床冠心病個性化診療提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象來源于河南大學第一附屬醫院心血管內科2017年9月至2019年9月收治的116例冠心病患者。納入標準：漢族，且無血緣關系；首次發病；因胸悶、心悸等癥狀入院，且經冠脈造影確診；接受PCI治療；PCI術前給予300 mg氯吡格雷，術后給予75 mg/d氯吡格雷聯合100 mg/d阿司匹林；精神認知正常；自愿接受基因檢測；可取得隨訪配合；簽署知情同意。排除標準：未行冠脈造影、無法確定冠脈病變情況者；合并糖尿病、甲狀腺疾病、肝腎功能不全等影響血脂代謝疾病；患有惡性腫瘤、急慢性感染、免疫系統、血液系統疾病；入組前半年內有調脂藥應用、抗血小板治療或輸血史；基因檢測結果無法辨識者。116例患者中男性71例、女性45例，年齡41～69歲，平均(56.28±12.24)歲，身體質量指數21.6～26.9 kg/m，平均(24.65±1.31)kg/m；冠脈病變單支35例，雙支47例，三支34例。

另選取80例經冠脈造影排除冠心病的心內科普通輕癥患者為對照組，除疾病相關診斷、治療標準外，其余納入、排除標準同冠心病組。對照組男性47例、女性33例，年齡37～70歲，平均(58.94±9.85)歲，身體質量指數20.5～26.2 kg/m，平均(24.47±1.14)kg/m；診斷：陣發性房顫29例，普通心肌炎27例，室性早搏24例。冠心病組與對照組性別、年齡、身體質量指數比較差異無統計學意義(

P

>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 基因多態性分析 EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血標本5 mL，采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產)，嚴格按試劑盒說明書提取全血細胞基因組DNA。應用紫光分光光度計(美國，QUAWELL公司，Q3000型)對樣品DNA濃度、純度進行測定，待測DNA樣品OD260/OD280≈1.8。應用PCR技術擴增ApoE特定基因片段，PCR擴增儀為美國ABI公司7500型實時熒光定量PCR儀，引物購自武漢天一輝遠生物科技有限公司。擴增產物送外檢(上海華大基因科技有限公司)，采用Sinochips-PGA基因芯片閱讀儀分析ApoE基因分型。根據rs429358、rs7412堿基種類分為3種純合子和3種雜合子，并歸為3類基因表型。二者均T純合為ε2/2型，rs429358 T純合、rs7412 T和C雜合為ε2/3型，rs429358 T純合、rs7412 C純合為ε3/3型，二者均T和C雜合為ε2/4型，rs429358T和C雜合、rs7412處C純合為ε3/4型，二者均C純合為ε4/4型，其中等位基因表型分型ε2/2型、ε2/3型歸為E2表型。ε3/3型、ε2/4型歸為E3表型，ε3/4型、ε4/4型歸為E4表型。

1.2.2 血脂檢測 EDTA抗凝管采集患者空腹12 h肘靜脈血標本5 mL，離心后(3 500 r/min，10 min)分離血清，采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀，檢測總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平，其中TC、TG檢測采用氧化酶法，HDL-C、LDL-C分別采用直接法、直接勻相法檢測。

1.2.3 冠脈病變嚴重程度評價 采用Gensini積分法評價冠脈病變嚴重程度，將冠脈分成14段，各節段對應一定權重系數，包括左主干病變(權重系數5)、前降支近段(2.5)、前降支中段(1.5)、前降支遠段(1)、回旋支近段(2.5)、回旋支遠段(1)、第一對角支(1)、第二對角支(0.5)、右冠脈近段(1)、右冠脈中段(1)、右冠脈遠段(1)、鈍緣支(1)、后降支(1)、左室后側支(1)；結合冠脈狹窄程度評分，其中狹窄程度≤25%、25%～50%、50%～75%、75%～90%、90%～99%、100%分別記1分、2分、4分、8分、16分、32分，各節段權重系數×狹窄程度評分相加之和即為Gensini總積分，分值越高，冠脈病變程度越嚴重。

1.2.4 氯吡格雷抵抗 于氯吡格雷首日給藥前、給藥后7天，采集(3.2%枸櫞酸抗凝管)空腹(10～14 h)肘靜脈血標本2 mL，2 h內于室溫條件下完成血小板聚集率(maximal platelet aggregation rate,MPAR)檢測，以5 μmol/L二磷酸腺苷為誘導劑，采用光比濁法測定MPAR，其中氯吡格雷給藥前、給藥后7天在二磷酸腺苷誘導下的MPAR差值≤10%視為存在CR，設為CR組，無CR者設為非CR組。

1.2.5 PCI術后臨床事件 術后1年內，經電話及門診隨訪，統計患者不良心血管事件(主要包括心源性死亡、不穩定型心絞痛、非致死性心肌梗死、支架內再狹窄等)及出血事件(主要包括皮膚黏膜出血、顱內出血、內臟出血等)發生情況。

2 結果

2.1 冠心病組與對照組血脂水平比較 冠心病組TC、TG、LDL-C水平均高于對照組(

P

<0.05)，兩組HDL-C水平比較差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表1。

表1 冠心病組與對照組血脂水平比較

2.2 冠心病組與對照組ApoE基因表型及等位基因頻率分布 冠心病組E4表型構成比及等位基因ε4頻率均高于對照組(

P

<0.05)。見表2。

表2 冠心病組與對照組ApoE基因表型及等位基因頻率分布[例(%)]

2.3 ApoE基因表型及等位基因與冠心病易感性 調整性別、年齡、血脂等混雜因素后，E4表型較E3表型冠心病風險增加2.41倍，攜帶ε4等位基因較ε3等位基因風險增加1.86倍。見表3。

表3 ApoE基因表型及等位基因與冠心病易感性

2.4 冠心病患者不同ApoE基因型間血脂水平比較 E4表型TC、LDC-C水平均高于E2、E3表型(

P

<0.05)；但3組TG、HDL-C水平比較差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表4。

表4 冠心病患者不同ApoE基因型間血脂水平比較

2.5 不同ApoE基因型間冠脈病變范圍分布比較 冠脈病變范圍在不同ApoE基因型間整體分布比較差異有統計學意義(

P

<0.05)，其中在E2、E3表型中，冠脈病變支數分布比較差異無統計學意義(

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>0.05)，但在E4表型中，三支病變構成比明顯高于單支病變，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表5。

表5 不同ApoE基因型間冠脈病變范圍分布比較[例(%)]

2.6 不同ApoE基因型間Gensini積分水平比較 E4表型冠脈病變嚴重程度Gensini積分高于E2、E3表型，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表6。

表6 不同ApoE基因型間Gensini積分水平比較分)

2.7 CR組與非CR組ApoE基因表型分布及等位基因頻率比較 116例患者中，共37例出現CR，檢出率31.90%。CR組E4表型構成比及等位基因ε4頻率均高于非CR組(

P

<0.05)。見表7。

表7 CR組與NCR組ApoE基因表型分布及等位基因頻率比較[例(%)]

2.8 ApoE基因表型及等位基因與CR易感性 調整性別、年齡、血脂等混雜因素后，E4表型較E3表型CR風險增加2.58倍，攜帶ε4等位基因較ε3等位基因風險增加2.26倍。見表8。

表8 ApoE基因表型及等位基因與CR易感性

2.9 不同ApoE基因型間PCI術后臨床事件的差異比較 隨訪1年內，E2、E3、E4表型患者PCI術后不良心血管事件、出血事件發和生率比較差異均無統計學意義(

P

>0.05)。見表9。

表9 不同ApoE基因型間PCI術后臨床事件的差異比較[例(%)]

3 討論

隨著人口老齡化進程加快以及人們飲食、生活習慣變化，我國冠心病發病率逐年上升，且有年輕化趨勢，該病已成為威脅人們健康與生活質量的重要慢性病之一。目前，冠心病發病機制雖未完全闡明，但已有流行病學研究顯示，血脂代謝紊亂與冠心病發病關聯密切，其中LDL-C及相關脂蛋白水平上升在啟動、維持動脈粥樣硬化方面占重要地位。近些年來，隨著分子生物學研究進展、精準醫學理念推廣以及基因檢測技術發展，基因檢測在臨床多種疾病診斷及預防中展現出良好應用前景，探究影響脂代謝基因與冠狀動脈疾病易感性關系已成為臨床研究熱點之一。

ApoE是機體最重要載脂蛋白之一，可作為配體與乳糜微粒受體結合，利于經腸道攝入的TC、TG進入肝臟代謝，而存在于肝細胞膜的ApoE受體也是乳糜微粒清除的決定因子；ApoE還能與肝臟中高密度脂蛋白受體、極低密度脂蛋白受體等結合，利于TC、TG的運輸及平衡分布；這些作用機制奠定了ApoE在機體脂質利用、轉運、儲存、排泄等方面的重要地位。人體ApoE基因多態性取決于19號染色體ε2、ε3、ε4三個常見等位基因，可決定6種基因型，一般歸為E2、E3、E4 3種基因表型，等位基因中以ε3出現頻率最高(50%～90%)，為野生型；ε2、ε4出現頻率則相對較低(分別1%～15%、5%～35%)，均為變異體，前者突變表現為同工蛋白質ApoE3上第158位置精氨酸突變為半胱氨酸，而后者表現為ApoE3上112位置半胱氨酸突變為精氨酸，這些氨基酸突變引起ApoE異構體對脂質蛋白受體親和力改變，繼而導致高脂蛋白血癥。相關文獻顯示，E3表型對血脂異常無明顯偏性，在人群中占比最高；E2表型為長壽基因型，無論是冠心病或非冠心病者，ApoE2攜帶者血漿ApoE濃度相比其他基因型往往更高，而血漿TC、LDL-C濃度更低，這主要因為ApoE2與LDL受體親和力下降，使得血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白及其殘基清除下降，繼而誘導肝細胞LDL受體反饋性升高，導致LDL分解增快，最終下調TC、LDL-C；而E4表型則與血脂異常升高有關，這可能因為相比ApoE3而言，ApoE4對脂蛋白代謝速率更快，血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白及其殘基清除增加，可誘導肝細胞LDL受體反饋性下調，從而使得TC、LDL-C水平升高。

本研究結果顯示，冠心病組E4表型構成比及ε4等位基因頻率明顯高于對照組，與E3表型相比，E4表型發生冠心病的

OR

值為2.41，且冠心病患者中E4表型組TC、LDC-C水平均明顯高于E2、E3表型，這提示ApoE4可能通過影響血脂代謝而增加冠心病發生風險。既往研究也認為ApoE基因多態性與冠心病發生發展關系密切，其可能作用機制有以下幾點：其一，ApoE不同表型表達的ApoE濃度不同，且以E4表型者最低，而高濃度ApoE在抗動脈粥樣硬化中具有重要作用；其二，不同ApoE異構體在機體代謝速率有較大差異，與相應受體結合活性也有所不同，其中以E4表型相對活性更高，可引起LDL受體反饋性下調，從而導致TC、LDL-C等水平明顯升高，而這些富含膽固醇脂蛋白經長期蓄積氧化，可誘導泡沫細胞形成，與冠心病發生關系密切；此外，ApoE基因多態性可通過與其他冠心病危險因素如吸煙、飲酒等相互作用，進一步增加冠心病風險。本研究結果發現，冠心病患者E3、E2表型中冠脈病變支數未表現出明顯差異，但在E4表型中，三支病變構成比明顯高于單支病變，且冠脈病變嚴重程度Gensini積分明顯高于E2、E3表型，提示冠心病ApoE4攜帶者可能更容易出現多支病變，且病情更嚴重。不過楊春霞研究認為，ApoE4攜帶者多支病變比例較ApoE2、ApoE3者比例更高，但通過危險因素分析，發現其與冠脈多支病變并無明顯相關性，這一結果可能受地域、飲食習慣、生活環境等影響，值得進一步研究。PCI是冠心病首選治療方式，不過PCI術后有一定支架內血栓形成風險，其發生可直接影響患者療效及預后，因此術后抗血小板治療十分重要。當前氯吡格雷是PCI術后常用抗血小板藥物之一，其應用可有效降低支架內血栓形成及術后不良心血管事件風險，且一般認為，氯吡格雷相比阿司匹林在防治心血管疾病方面效果更優。但在實際中，由于CR現象存在，患者治療效果大打折扣，早期識別患者CR風險對指導PCI術后個體化用藥、改善預后具有重要意義。臨床上影響氯吡格雷代謝因素較多，基因多態性被認為是其中最重要因素之一。本研究發現，CR組E4表型構成比及等位基因ε4頻率均明顯高于非CR組(

P

<0.05)，而與E3表型相比，E4表型發生CR的OR值為2.58，提示ApoE4攜帶者可能存在更高的CR風險。目前，雖無直接證據證實ApoE基因多態性與CR相關，但有研究認為，血漿高LDL-C水平是影響PCI術后CR的危險因素之一，其原因在于高血脂患者血液多處于高凝狀態，血管內皮功能、纖溶系統易受損，可影響血小板膜結構、降低抗血小板效果，故可出現CR現象，而ApoE4攜帶者血漿LDL-C較非攜帶者往往明顯升高，或可以解釋這一結果。但本研究發現，隨訪1年內，E2、E3、E4表型患者PCI術后不良心血管事件、出血事件發生率并無明顯差異，這一結果提示ApoE基因多態性對血脂影響可能并不足以直接增加患者PCI術后不良心血管事件風險，該結果也可能受研究樣本量限制，后期可擴大樣本分析，進一步為患者后期不良心血管事件防控提供依據。

綜上所述，冠心病患者ApoE基因E4表型比例相比非冠心病者增加，且與患者血脂、冠脈病變范圍、病變嚴重程度以及PCI術后氯吡格雷抵抗有一定關系，檢測該類人群ApoE基因多態性或可為其病情評估、疾病防治、PCI術后用藥指導等提供依據，值得深入研究。