遺傳性牙本質發育不全Ⅱ型牙本質涎磷蛋白基因多態性分析

吳常偉，董 紅

（1.首都醫科大學燕京醫學院，北京 101300；2.湖北醫藥學院附屬東風口腔醫院，湖北 十堰 442000）

遺傳性牙本質發育缺陷性疾病是一類累及乳牙或恒牙，主要有兩大類：一類為牙本質發育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI），另一類為牙本質發育不良（dentinogenesis dysplasis，DD）。DGI 臨床上有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種表型，DD 有Ⅰ型和Ⅱ型兩種表型。DGI-Ⅰ與成骨不全相關的遺傳性牙本質缺陷，DGI-Ⅱ、DGI-Ⅲ和DD-Ⅱ是獨立的遺傳性牙本質缺陷[1-3]。最常見的是DGI-Ⅱ（OMIM 125490），患者乳牙、恒牙均受累，尤以乳牙更嚴重，牙本質呈現特殊的乳白色使牙齒外觀為半透明乳光色，因此又稱為遺傳性乳光牙本質（hereditary opalescent dentin），人群中的發病率為1/8000～1/6000，外顯率幾乎100%，具有高表達性和低頻率新生突變。組織學觀察：牙本質小管稀疏、排列也不規則，牙本質礦化程度明顯下降；沿釉質生長線釉質中斷處可發生牙釉質斷裂[4-7]。目前研究認為，牙本質涎磷蛋白基因（dentin sialophosphoprotein，DSPP）是DGI-Ⅱ的致病基因。本研究針對牙本質發育異常、臨床上確認為遺傳性牙本質發育不全Ⅱ型的兩個獨立家系進行DSPP 基因檢測分析，以進一步闡明DSPP 基因突變與牙本質發育異常之間的關系，擴大牙本質發育異常的DSPP 基因突變譜。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 兩個家系來自湖北省十堰市4 代21人，患者牙齒呈半透明淺藍色至棕黃色，釉質剝脫，牙本質較軟，牙冠磨損嚴重，X 線片顯示髓腔和根管狹窄或閉塞，乳牙、恒牙均受累。但無成骨發育不全癥狀和聽力喪失，確診為遺傳性牙本質發育不全Ⅱ型。征得患者和家屬同意采集兩個家系成員血樣，家系1 采集血樣8 份，其中患者3 份；家系2 采集血樣1 份，即先證者血樣。用一次性末梢采血針采血，FTA 洗脫卡（Whatman Cat No.WB120412）收集血樣，取100 μl 末梢血加入FTA 洗脫卡圓圈的中心位置，血樣自動向外擴散，含樣本的位置由粉色轉變為白色，80 ℃干燥30 min 后室溫保存，采樣時間2017 年10 月。

1.2 基因組DNA 提取 ①用直徑2 mm 的打孔器對FTA Elute 卡打孔獲取小圓片，轉移至1.5ml EP 管；②向EP 管中加入500 μl 無菌水，混懸3 次，5 s/次，立即將EP 管中的水吸出；③使用無菌槍頭將EP 管中的小圓片轉移至0.5 ml EP 管中，加入30 μl 無菌水至0.5 ml EP 管；④將0.5 ml EP 管放至加熱器中98 ℃30 min；⑤混懸均勻后，將小圓片用槍頭挑出，EP 管中的溶液即為洗脫下來的基因組DNA。

1.3 PCR 引物設計合成 人類DSPP 基因序列從NCBI 網上獲取（Genbank 序列號AF163151.2），引物設計覆蓋DSPP 基因的5 個外顯子及臨近區域。依據擴增長度和測序要求，將DSPP 基因外顯子1、2各一個片段，外顯子3、4 一個片段，外顯子5 分成中間重疊的4 個片段。引物由北京新時代科技有限公司合成，PAGE 純化，使用前加雙蒸水至引物濃度為10 μmol/L，見表1。

表1 DSPP 基因編碼區引物序列

1.4 PCR 擴增 PCR 反應體系為50 μl，上、下游引物各1 μl，基因組DNA 0.8 μl，2×Taq plus PCR MasterMix（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）25 μl，ddH2O 補充至50 μl。PCR 反應程序為為94 ℃預變性5 min，然后按94 ℃40 s，56 ℃～58 ℃50 s，72 ℃2 min，循環35 次，在72 ℃8 min。

1.5 擴增產物鑒定與回收 反應結束取6 μl PCR 產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段。切膠回收PCR 產物的片段用天根生化科技（北京）有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明進行。

1.6 擴增產物測序分析 測序工作由由北京新時代科技有限公司完成，測序結果均經雙向測序證實。用Chromas 軟件查看測序結果，DNA 和蛋白質序列比對用BLAST 軟件分析。

2 結果

2.1 擴增產物鑒定 兩個DGI-Ⅱ家系9 個樣本的DSPP 基因編碼區除外顯子5 中的高度重復序列（Exon5-3）外的6 個片段均成功擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與其大小一致。

2.2 擴增產物測序分析 兩個家系DSPP 基因編碼區的擴增片段中存在3 個堿基替換：外顯子4 的c.847G＞A（p.D243N）、c.1017A＞G（p.S299S）和外顯子5 的c.2091C＞T（p.G657G）。外顯子4 的c.847G＞A（p.D243N）的情況在患者和未患病的家庭成員中都存在，沒產生遺傳學效應屬于中性突變，外顯子4 的c.1017A＞G（p.S299S）和外顯子5 的c.2091C＞T（p.G657G）屬于同義突變，見圖1～圖3。

圖1 外顯子4 的第243 密碼子G>A 的置換

圖2 外顯子4 的第299 密碼子A>G 的置換

圖3 外顯子5 的第657 密碼子C>T 的置換

3 討論

DGI-Ⅱ是一種常染色體顯性遺傳病，其致病基因DSPP 位于4q22.1，結構基因DNA 序列全長9944 bp，由5 個外顯子和4 個內含子組成[8，9]，DSPP基因編碼1301 個氨基酸的DSPP 蛋白，是牙本質中主要的非膠原蛋白，DSPP 基因的表達具有組織特異性，主要在成牙本質細胞和成釉質細胞中表達，也在其他器官也有不同程度的表達。DSPP 蛋白經切割產生大小不同、功能各異的兩個片段：牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）和牙本質磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP），其中外顯子2-4 編碼DSP 的N 端，外顯子5 編碼DSP 的C 端和DPP[10，11]。DSP 蛋白是一種糖基化蛋白，大部分糖基是涎酸，因此被命名為牙本質涎蛋白，在牙本質基質中DSP 占牙本質非膠原蛋白總量的5%～8%，在牙本質發育的礦化過程中作用很小。DPP 牙本質基質中主要的非膠原蛋白，約占牙本質非膠原蛋白總量的50%。DPP 的重要特征是富含絲氨酸和天冬氨酸,是體內酸性很強的蛋白，而且多數絲氨酸磷酸化，組成大量次數不同的DSS、DS 的重復序列，高含量的天冬氨酸和磷酸絲氨酸使DPP 蛋白帶有大量的陰離子，并與鈣離子有高強度的親和力。DPP 蛋白對牙本質形成和礦化起主要作用：與Ⅰ型膠原纖維結合集中于礦化前沿控制羥基磷灰石晶體的起始，在礦化過程中與其他蛋白結合在羥基磷灰石結晶表面控制晶體的形狀和大小[12，13]。目前在不同人群中發現DSPP 基因的40多個致病基因突變中位于DSP 編碼區多數為錯義突變或無義突變[14，15]；位于DPP 編碼區的多為移碼突變[16-19]。根據上述突變可以大致推測，DSP 編碼區的堿基突變可能干擾DSPP 蛋白的運輸與加工，最終影響牙本質的形成；DPP 編碼區的移碼突變可能破壞牙本質成熟的整個過程。

本研究中，兩個DGI-Ⅱ家系DSPP 基因測序結果顯示突變均位于DSP 編碼區：外顯子4中c.847G＞A（p.D243N），該突變在DGI-II 家系正常成員和患者中均存在，即氨基酸的改變并不影響DSPP 蛋白的功能，屬于中性突變；外顯子4：c.1017A ＞G（p.S299S）和外顯子5：c.2091 C ＞T（p.G657G）屬于同義突變。因此，以上3 個堿基替換均表現為單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。

人類基因組計劃雖然順利完成，但發現仍存在大量的未解之謎。隨著基因突變產生多種多樣的遺傳變異不斷引入人類基因庫，導致遺傳多態性。人類基因組中常見的遺傳多樣性有SNP、插入缺失多態性、拷貝數多態性和倒位多態性等[20-22]。其中SNP數量多、分布廣、遺傳穩定，作為第三代的SNP 遺傳標記技術應用廣泛。利用SNP 遺傳標記進行遺傳學研究，如不同人種的眼睛虹膜顏色差異是由相關基因中的SNP 所決定；利用SNP 遺傳標記也進行疾病與基因關聯的醫學研究，致病基因定位、克隆與鑒定、疾病的基因診斷和精準醫療[23]；此外SNP 遺傳標記普遍用于司法的親子鑒定。上述外顯子4 中c.847G＞A（p.D243N）突變是一個突變熱點，可作為SNP 遺傳標記[6]。

相較常規的核酸提取方法，Whatman FTA 卡的最大優勢就在于集樣本采集、保存、運輸及核酸下游處理于一體。FTA 卡分為洗脫卡和非洗脫卡，基于不同的需求應用和下游處理方法選擇具有特定功能的FTA 卡。本研究使用FTA 洗脫卡，血樣加入濾膜上被裂解，蛋白質被結合在纖維基質上，室溫干燥條件可以長時間保存，而DNA 直接被洗脫以溶液形式保存。相較于常規的DNA 提取技術，此方法提取DNA 快速、簡便、高效，利用FTA 卡進行樣本采集和核酸洗脫不失為可推薦的常規核酸提取替代方法。

綜上所述，對兩個DGI-Ⅱ家系的DSPP 基因檢測所發現的三個堿基置換均表現為單核苷酸多態性,該研究為DGI-Ⅱ致病基因克隆鑒定、實施精準醫療奠定基礎。雖然DSPP 基因突變檢測技術成熟，但特定突變與臨床癥狀的相關性和具體機制仍不明確，DSPP 基因中的高度重復序列區域或者基因以外區域是否存在符合DGI-Ⅱ表型的基因突變有待進一步研究。