丹酚酸B 對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的保護作用

莊新怡，胡嘉奕，丁璐楠，韋思明

（浙江樹人大學樹蘭國際醫學院，浙江 杭州 310015）

睪丸扭轉（testicular torsion）是一個常見的泌尿科急癥，在25 歲以下的男性中發病率為1/4000，它導致了睪丸缺血[1]。外科手術復位可以恢復睪丸血流，避免睪丸梗死。但是，即使成功復位，41.4%的病例仍發生了睪丸萎縮、生精功能降低[2]。睪丸扭轉復位所誘導的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷。在缺血再灌注過程中，活性氧過量產生，在睪丸損傷中扮演著一個關鍵的角色[3-5]。過量的活性氧，包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，誘導細胞膜脂質過氧化、蛋白變性和DNA 斷裂，最終導致了組織損傷和細胞死亡[6]。到目前為止，對于睪丸缺血再灌注損傷缺乏手術后的臨床輔助治療。據報道，丹酚酸B擁有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗感染和抗纖維化等[7，8]。已有研究證實，丹酚酸B 能減輕心臟的缺血再灌注損傷[9]。丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷的效應從來沒有被研究過。本研究通過建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探索丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷的效應及其機制，為睪丸缺血再灌注損傷的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 60 只體重在250～300 g 的成年雄性SD 大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，丹酚酸B 和抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自于Sigma 化學公司，抗環磷酸腺苷反應元件調控因子τ（cAMP-responsive element modulator-τ，CREMτ）抗體來自于Santa Cruz 生物技術公司，丙二醛分析試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 采用隨機數字表法將60 只大鼠隨機分成對照組、缺血再灌注組和治療組，每組20 只。氯胺酮（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉后，大鼠被固定在手術臺上，消毒鋪巾。經左側髂腹股溝切口，取出左側睪丸。對照組大鼠以1 根11/0 無創傷絲線穿過睪丸白膜，然后睪丸放回陰囊，縫合皮膚切口。缺血再灌注組大鼠逆時針扭轉左側睪丸720°來誘導睪丸缺血，接著用11/0 絲線固定扭轉睪丸到陰囊上，維持睪丸缺血狀態。2 h 后，睪丸恢復到正常位置，誘導睪丸血液再灌注。睪丸仍然存活，放回陰囊。治療組接受了與缺血再灌注組同樣的外科處理，但在再灌注時，從尾靜脈注射10 mg/kg 丹酚酸B 予以治療。灌注后4 h，每組一半大鼠的雙側睪丸被切除，用以分析丙二醛水平，然后這些大鼠通過吸入二氧化碳行安樂死。灌注后3 個月，每組剩余一半大鼠的睪丸用以評估CREMτ 蛋白表達和睪丸生精功能。

1.3 睪丸組織中丙二醛測定 睪丸組織在丙二醛裂解緩沖液中攪勻，然后組織勻漿在4 ℃以5000 r/min的速度離心15 min，獲取上清液用于丙二醛的測定。用硫代巴比妥酸反應物質試驗來確定睪丸組織的丙二醛含量，操作步驟按照試劑盒生產廠家的說明書進行。

1.4 CREMτ 蛋白表達的分析 參考Liu H 等[10]的方法抽提睪丸組織的蛋白。抽提的蛋白通過電泳進行分離，然后轉移到硝酸纖維濾膜上。膜上的非特異性結合位點用含5%脫脂奶粉的溶液進行封閉，隨后濾膜在4 ℃與CREMτ 一抗、β-actin 一抗一起孵育過夜。第2 天，濾膜在室溫下與辣根過氧化物酶結合的二抗一起孵育1 h。然后用增強的化學發光探測試劑顯示膜上蛋白條帶，接著定量條帶強度。CREMτ 條帶與來自同一樣本的內參照β-actin 條帶的強度比值作為CREMτ 蛋白的相對表達水平。

1.5 睪丸生精功能的測定 通過測定睪丸重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分這些指標來評定睪丸生精功能。睪丸切下后在電子秤上稱重，然后波恩氏液固定、石蠟包埋。從石蠟塊上切下5 μm厚的薄片，脫蠟后，蘇木素-伊紅染色。從每一個切片上選取20 個圓的曲細精管，在顯微鏡下測量其直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分，然后計算其平均值。顯微鏡的目鏡上裝有測微尺，可以測量曲細精管直徑；在每一個曲細精管，從基底膜到管腔計數生精細胞層數；根據生精細胞發育成度，對精子發生做Johnsen 評分。

1.6 統計學分析 用GraphPad Prism 軟件（4.0 版本）來進行統計學分析。計量資料采用（）表示，使用單因素方差分析和q檢驗來比較組間數據，組內同側和對側睪丸之間的比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組睪丸組織內的丙二醛水平比較 缺血再灌注組同側睪丸（即左側缺血再灌注睪丸）的丙二醛水平高于對照組、治療組，差異有統計學意義（P＜0.05）；三組對側睪丸（即右側睪丸）的丙二醛水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組睪丸組織內的丙二醛水平比較

2.2 各組睪丸CREMτ 蛋白表達比較 缺血再灌注組同側睪丸的CREMτ 蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組同側睪丸的CREMτ 蛋白表達高于缺血再灌注組，差異有統計學意義（P＜0.05）；三組間對側睪丸的CREMτ 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組睪丸CREMτ 蛋白表達比較

2.3 各組睪丸生精功能 缺血再灌注組同側睪丸的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組同側睪丸的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分均高于缺血再灌注組，差異有統計學意義（P＜0.05）。三組對側睪丸的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。對照組睪丸可觀察到正常的曲細精管直徑和生精細胞層數，在曲細精管內有許多成熟的精子和一個開放的管腔；缺血再灌注組同側睪丸表現出曲細精管萎縮和生精細胞層數減少；治療組同側睪丸曲細精管的結構幾乎符合正常標準，曲細精管內可見成熟的精子，但曲細精管的管腔內包含有脫落的生精細胞，見圖4。

圖3 各組睪丸的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分比較

圖4 各組睪丸的病理組織學切片

3 討論

如果睪丸扭轉持續超過6 h，將導致睪丸梗死[11]。即使在這段時間內行外科手術復位，患者術后仍會出現睪丸萎縮[2]。本次研究顯示，單側睪丸扭轉2 h 后復位，雖然睪丸仍然存活，但復位后3 個月，睪丸生精功能嚴重損傷，表現為睪丸重量、曲細精管直徑、生精細胞層數和Johnsen 評分降低。睪丸扭轉復位后的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷。但目前對于睪丸缺血再灌注損傷的機制仍然不明。

CREMτ 充當著男性生精細胞分化的總開關，調控著生精細胞特異基因的轉錄[12]。缺乏CREMτ 基因的小鼠睪丸重量減輕20%～25%，曲細精管直徑降低20%～30%，精子發生停滯在早期階段[13]。因此，CREMτ 表達對精子發育成熟必不可少。本次研究發現，單側睪丸缺血再灌注后3 個月，同側睪丸的CREMτ 表達降低，生精功能也嚴重損傷。由于CREMτ 表達對精子發育成熟必不可少[13]，所以單側睪丸缺血再灌注后同側睪丸CREMτ 表達的降低可能導致了睪丸生精功能的損傷。然而，CREMτ 表達降低的原因仍然不明。

活性氧包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等。活性氧具有高反應性和壽命短的特點，直接定量檢測活性氧較為困難，而活性氧能引起細胞膜脂質過氧化產生穩定的末端產物丙二醛。因此，丙二醛被廣泛作為一個敏感的活性氧指標[14]。本次研究發現，在單側睪丸缺血再灌注后，同側睪丸的丙二醛水平上升，表明睪丸缺血再灌注后會有過量的活性氧產生。活性氧可以通過調控基因的表達來影響細胞的分化[15]，結合上述的研究結果，提出以下假設：睪丸缺血再灌注后，過量產生的活性氧可能通過下調CREMτ 的表達來造成生精功能損傷。

當前，一些藥物，如己酮可可堿，姜黃素和勃銳精等，已被證實在動物模型中治療睪丸缺血再灌注損傷是有效的[16-18]。然而，目前尚無藥物可用于臨床治療睪丸缺血再灌注損傷的患者。丹參是我國的傳統中藥，具有活血化瘀的功效，已廣泛應用于心腦血管疾病（如心絞痛、心肌梗死和腦梗死等）的臨床治療中[19]。丹酚酸B 是丹參中最豐富的生物活性成分，能清除活性氧，擁有極強的抗氧化活性[20]。據報道[9]，丹酚酸B 能降低心臟的缺血再灌注損傷。然而，丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷是否有保護作用，還未見報道。本研究發現，相比于缺血再灌注組，丹酚酸B 治療可降低同側睪丸的丙二醛水平，提高CREMτ的表達和生精功能，證實了上述的假設。同時，這些數據還表明，丹酚酸B 通過清除活性氧來上調CREMτ 表達，從而減輕睪丸的缺血再灌注損傷。

既往研究顯示[9]，丹酚酸B 在10 mg/kg 的劑量時能減輕大鼠的心臟缺血再灌注損傷。因此，本研究在大鼠睪丸缺血再灌注模型中選擇了這個劑量。研究發現，相比于缺血再灌注組，10 mg/kg 的丹酚酸B 治療可改善同側睪丸的生精功能，但是生精功能沒有恢復到正常水平。后期，本研究將進一步探索丹酚酸B 的最佳治療劑量。

綜上所述，丹酚酸B 對睪丸的缺血再灌注損傷有保護作用，其可能成為在臨床上治療睪丸缺血再灌注損傷的藥物，但需要進一步的臨床試驗進行驗證。

致謝：感謝浙江樹人大學樹蘭國際醫學院的戴欣怡、吳雨桐、柴敏嬌等人在實驗中的幫助。