仔豬腹瀉病原菌分離及其防治

林松泉

（廈門惠盈動物科技有限公司，福建 廈門 361023）

新生仔豬黃、白痢是一種常見的細菌性疾病，主要是由大腸桿菌引起的，其發病率與死亡率較高[1-2]，尤其在冬季及早春時期，更容易暴發，該病已成為影響我國養豬業發展的因素之一[3]。在福建某養豬場，剛出生仔豬突發腹瀉、死亡的情況，表現為腹瀉，排出黃色或黃白色的稀糞或水樣糞，且該病具有傳染性。發病主要為1～3日齡的仔豬，在發病的2～4 d出現死亡，且死亡率高。通過解剖觀察，可見小腸充血，內有黃色液狀內容物，脹氣。

在國內關于仔豬腹瀉防治的相關報道較多，但多數主要是采用磺胺嘧啶[4]、抗生素類藥物[5-6]來治療，而采用益生菌“以菌治菌”的報道較少。本研究通過對小腸內容物及稀糞進行病原菌分離、鑒定，并進行藥物敏感性及益生菌抑制試驗，為防治仔豬腹瀉提供理論依據，并分析益生菌制劑替代抗生素的可行性，為畜禽養殖業往無抗、減抗發展奠定基礎。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 發病仔豬稀糞及小腸內容物。福建某發病豬場無菌收集腹瀉仔豬新鮮糞便、抽取剖檢仔豬小腸內容物，低溫保存。

1.1.2 試驗菌株。枯草芽孢桿菌GDM1.372（Bacillus subtilis）、 地 衣芽孢 桿 菌 GDM1.11（Bacillus licheniformis）、 凝 結 芽 孢 桿 菌 GDM1.645 （Bacillus coagulans）、 植物乳桿菌 GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、 干酪乳桿菌 GDM1.80（Lactobacillus casei）、 嗜 酸 乳 桿 菌 GDM1.208 （Lactobacillus acidophilus）、 產朊假絲酵母 GDM2.148（Candida utilis）和 釀 酒 酵 母 GDM2.90（Saccharomyces cerevisiae）購自廣東省微生物菌種保藏中心；鼠李糖乳桿菌 （Lactobacillus rhamnosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）為本實驗室分離純化。

1.1.3 試驗藥物及動物。營養瓊脂，生產批號：1101791，廣東環凱微生物科技有限公司產品；營養肉湯，生產批號：1094671，廣東環凱微生物科技有限公司產品；無菌脫纖維兔血，生產批號：20210818001，南京全隆生物技術有限公司產品；13種藥敏紙片，生產批號：210512，杭州濱和微生物試劑有限公司產品；慶大霉素，生產批號：210618，上海沃凱化學試劑有限公司產品；頭孢哌酮(先鋒必)，生產批號：20210708，輝瑞制藥有限公司產品；28日齡BALB/c小鼠購自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病菌分離及鑒定。取小腸內容物、稀糞各10 g分別加入90 mL無菌生理鹽水，搖勻后再稀釋10倍，取10-2稀釋度0.1 mL涂布于營養瓊脂平板，于37℃好氧培養48 h，待長出單菌落后，挑取菌落劃線純化。純化后進行革蘭氏染色、鏡檢，初步判斷菌株類別，后將菌株進行16S rRNA測序，其中正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'[7]，所得序列通過美國生物技術信息中心（NCBI）數據庫BLAST進行在線同源性比對，并進行革蘭氏染色特性、糖發酵試驗、V-P試驗、吲哚反應、硝酸鹽還原和明膠液化等生理生化試驗，從而確定菌株名稱。

1.2.2 溶血性試驗。將純化后的菌株，挑取一環菌泥，稀釋于無菌生理鹽水中，備用。將無菌圓形濾紙片貼于含5%的兔血瓊脂平板上，吸取50 μL菌液接種于無菌圓形濾紙片上，37℃好氧培養48 h，觀察有無溶血圈形成。

1.2.3 藥物敏感性試驗。將純化后的菌株活化后，挑取一環菌泥采用無菌生理鹽水稀釋，使終菌濃約為108CFU·mL-1，備用。吸取1 mL菌懸液加入50℃保溫的100 mL營養瓊脂培養基中搖勻，傾倒平板，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min后，將平皿置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.2.4 益生菌抑菌試驗。采用牛津杯法[8]，從活化后的病菌中挑取菌泥，稀釋至活菌數約108CFU·mL-1，吸取1 mL菌懸液加入50℃保溫的100 mL營養瓊脂培養基中搖勻，傾倒平板，冷卻凝固后將牛津杯置于平板上，往牛津杯中加入發酵培養24 h的益生菌培養液 0.25 mL（菌濃約為 108CFU·mL-1），置于 37 ℃環境中培養24 h。觀察有無抑菌圈產生，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。

1.2.5 動物致病性及治療試驗。選取100只健康小鼠隨機分成5組，每組20只，分別為對照組、病菌感染組、慶大霉素組、頭孢哌酮組和益生菌組。其中病菌感染組、慶大霉素組、頭孢哌酮組和益生菌組的小鼠腹腔注射菌濃度約為106CFU·mL-1的病菌懸液，用量為0.5 mL/只，對照組注射0.5 mL/只的0.85%無菌生理鹽水。慶大霉素組與頭孢哌酮組按1 g/kg體重用藥量加入日糧及飲水中，而益生菌組在日糧及飲水中按1 g/kg體重加入復合乳酸菌發酵培養液。3組日常喂食、管理一致，飲水自由，連續觀察7 d，計算小鼠死亡只數，并剖檢死亡小鼠，取臟器進行病菌分離。

1.2.6 數據處理。試驗數據采用Excel 2020整理及標準差分析，結果以 “平均數±標準差”表示，并采用SPSS22.0軟件中Duncan法進行多重比較分析，其中P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 病菌分離及鑒定

在腹瀉仔豬的小腸內容物及糞便中均分離出一株活菌數為104CFU·g-1的菌株，通過菌落形態及鏡檢菌體形態，初步判斷為同一種菌株。后經16S rRNA測序，BLAST同源性比對，結果表明該菌株基因系列與Escherichia coLi SCLE84的同源性為99.95%。

菌株的生理生化試驗結果為：MR試驗、吲哚反應和糖發酵產酸產氣等試驗結果為陽性，V-P試驗、蔗糖利用和檸檬酸鹽利用等試驗為陰性，具體結果如表1所示。

表1 分離菌株生化鑒定結果

由16S rRNA測序經BLAST同源性比對，結果與表1菌株的生化鑒定結果相結合，根據《常見細菌系統鑒定手冊》，可以明確分離的菌株為大腸桿菌。

2.2 溶血性試驗

分離菌株經含5%兔血瓊脂培養基培養48 h后，出現明顯的溶血圈，大小可達42.15±0.15 mm，說明該菌株具有溶血性。

2.3 藥物敏感性試驗

分離菌株經左氟沙星、諾氟沙星和頭孢克洛等13種抗菌藥物的敏感性試驗。結果表明，菌株對左氟沙星、鏈霉素、四環素、青霉素G、氨芐青霉素和萬古霉素表現出耐藥性，對諾氟沙星、紅霉素中度敏感，對頭孢克洛、頭孢哌酮、頭孢呋辛、氯霉素和慶大霉素表現敏感，具體如表2所示。

表2 分離菌株藥敏試驗結果

2.4 益生菌抑菌試驗

分離菌株經枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌等10株益生菌的發酵培養液抑制，結果如表3所示。分離菌對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母及產朊假絲酵母表現為低敏感，對戊糖片球菌表現為中敏感，對凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌表現為高敏感。

表3 益生菌對大腸桿菌的抑制效果

2.5 動物致病性及治療試驗

將分離菌進行小鼠致病性試驗，并通過分析分離菌的藥敏試驗、益生菌抑制試驗結果，選取慶大霉素、頭孢哌酮兩種抗菌藥與復合乳酸菌對感染分離菌的小鼠進行治療，具體試驗結果如表4所示。病菌感染組在3 d內死亡率達95%，說明該分離菌具有較強的致病性。慶大霉素組死亡率為20%，頭孢哌酮組死亡率為10%，而益生菌組死亡率為25%，這3組的死亡率與對照組無顯著性差異 (P＜0.05)，在相同的用藥劑量下，頭孢哌酮的治療優于慶大霉素，慶大霉素治療效果與益生菌組差異不大。在死亡小鼠的腸道、肝臟皆分離出與所注射菌株一致的病菌，未死亡小鼠剖檢后發現臟器未發生病變。

表4 大腸桿菌對小鼠致病性及治療

3 討論

從腹瀉仔豬的小腸內容物及糞便中分離出一株活菌數為104CFU·g-1的菌株，經16 S rRNA測序及生化特征鑒定為大腸桿菌，且該菌具有溶血性，感染小鼠3 d內死亡率達95%，說明分離菌具有較強的致病性，所以可以推測導致該養豬場仔豬發生腹瀉死亡的病原菌主要為致病性大腸桿菌。通過藥敏試驗可知，該病菌對大多數的抗生素具有耐藥性，但對頭孢類藥物表現敏感。在益生菌抑菌試驗中，多數的乳酸菌能有效抑制該病菌，在動物試驗中，復合乳酸菌對感染病菌的小鼠治療效果與抗生素差異不大，說明復合乳酸菌具有替代抗生素的潛力。

高飛等[10]、宋德平等[11]及付月華等[12]發現，從腹瀉仔豬糞便中分離出的大腸桿菌對頭孢類藥物敏感，對常規多種抗生素具有耐藥性，該研究與本研究結果較為一致。而大腸桿菌對頭孢類藥物敏感，對常規抗生素耐藥，原因可能為頭孢類藥物價格較貴，養殖戶使用較少，所以大腸桿菌對它們還沒有產生抗藥性。且不同來源的大腸桿菌耐藥性不盡相同，隨著抗生素的長期使用致使大腸桿菌的耐藥性不斷提高[13-14]。

益生菌在豬大腸桿菌的防治運用中，陸克文等[15]、陳明亮等[16]主要介紹乳酸菌對豬大腸桿菌疾病的防治。乳酸菌可以通過產生抗菌物質，從而能有效抑制有害菌[17-19]，而凝結芽孢桿菌則可以通過產生凝固素（coagulin）、lactosporin 及乳酸來抑制病原菌[20-21]。 在本研究中，復合乳酸菌發酵液在治療感染病菌的小鼠中所表現出來的效果與抗生素基本一致，但抗生素的使用不僅提高病菌的耐藥性、而且還會造成藥物殘留及破壞生態環境[22]，畜禽肉類產品中藥物殘留會危害人體健康[23-24]，而益生菌制劑則無上述危害。故益生菌制劑在畜禽養殖過程中具有良好的運用前景，可成為抗生素重要替代品之一[25]。

4 結論

從腹瀉仔豬的小腸內容物及糞便中分離出一株具有較強致病性、溶血性的大腸桿菌，該菌對多種抗生素表現出耐藥性，對頭孢抗菌藥物則表現為敏感，但能被植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等乳酸菌發酵液抑制。故建議養殖場在治療動物細菌性疾病時，先做病菌分離、藥物敏感性試驗，選擇有效的抗菌藥物，對癥下藥，避免抗生素濫用。而養殖過程中使用益生菌制劑，可以有效減少或預防細菌性疾病的發生。