GZAS20200701 分離毒株gp85 基因克隆與序列分析

馬燕 溫貴蘭* 陳廣 張喜懿 張小波 鞏雪竹 韋秒粘 王興明

（1，貴州大學動物科學學院 550025；2，貴州省動物疫病預防控制中心 550025）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的雞良性或惡性腫瘤性疾病，自然條件下以淋巴白血病最為常見，其他如成紅細胞白血病、成髓細胞白血病、髓細胞瘤等出現的頻率很低。ALV 按照其囊膜糖蛋白抗原差異和病毒干擾試驗等被分為A～K 等11 個亞群[1]。其中A～D 亞群的病毒屬于外源性病毒，E 亞群為內源性病毒，不具有感染性，而J 亞群的致病性和感染力較強。ALV 有垂直傳播和水平傳播兩種傳播方式，可使雞群感染，發生免疫抑制，使雞的生長速度受到影響，亦或發生死亡。蛋雞患感染后其產蛋性能受到嚴重影響，同時會繼發感染其他的病毒病和細菌病，給養殖業帶來巨大的經濟損失[2]。20 世紀90 年代初，英國學者初次從肉雞體內分離到一種新型的禽白血病病毒J 亞群，J 亞群對雞群有很高的致病性，相對于其他亞群，其傳染性最強，世界各地均有本病存在[3]。在20世紀90 年代末，我國第一次在肉雞中發現了ALV-J，而后隨著人類生活水平的提高和需求擴大，病毒的宿主范圍也因此逐漸擴大，在一些商品化蛋雞和地方品種雞中都有分離到該病毒，在野鳥體內也發現過該病毒[4]。ALV-J 基因組主要含有gag、pol 和env 3 個基因，其中gag 和pol 基因都十分保守，而包括gp85 在內的env 基因則有很大的變異，很大原因是受env基因編碼的表面囊膜蛋白gp85 干擾，gp85 是識別靶細胞膜上的特異性病毒受體，是禽白血病病毒抗原的主要成分，有高度可變性，其抗原性能決定病毒的亞群特異性[5]。高腳雞是貴州省的特色地方品種，1982 年以“高腳雞”命名載入《貴州省畜禽品種志》，2006 年載入《中國畜禽資源名錄》，高腳雞由于生態分布范圍窄，生態環境脆弱，生長遲緩，產蛋量和繁殖率低，沒有引起養殖戶的高度重視，目前正面臨消失。本研究通過PCR 技術、同源性分析和系統進化樹分析等方法對高腳雞的ALV-J-gp85 基因序列進行分析，為高腳雞養殖場提供一定的防控和凈化禽白血病的技術支撐和數據參考，使高腳雞得到更好的保存與發展。

1 材料

1.1 試驗樣品

貴州省某養殖場26 只送檢高腳雞的血清樣品。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒，購自世紀元亨公司；2×Es Taq DNA 聚合酶，購自康為世紀有限公司；反轉錄試劑盒、DL 2000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連) 有限公司。

1.3 引物設計

參考文獻合成ALV-A、ALV-B 和ALV-J[6]三重PCR 引物，根據GenBank 公布的ALV-J 原型毒株HPRS103 基因序列（GenBank 登錄號：Z36973)，采用Primer Premier 5.0 軟件設計了一對J 亞型禽白血病病毒gp85 特異性檢測引物。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列信息

2 方法

2.1 ALV p27 抗原ELISA 檢測

使用北京維德維康生物技術有限公司的禽白血病病毒抗原檢測試劑盒（ALV Antigen Test Kit）對采集的26 份高腳雞血樣進行檢測。計算公式如下：

2.2 RNA 提取與反轉錄

根據說明書在無菌、干凈的條件下提取樣品中的病毒總RNA，然后置于-70℃進行保存，備用。以提取的總RNA 為模板進行反轉錄，反轉錄體系如表2。

表2 反轉錄體系

42℃孵育40min，85℃孵育5min，然后置于-70℃保存備用。

2.3 ALV-A/B/J 亞型RT-PCR 擴增

反應體系：ddH2O 6μl，2×Taq MasterMix 10μl，cDNA 2.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，共計20.0μl。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性1min，57℃退火30s，72℃延伸2min，共進行35 個循環；最后72℃再延伸10min，然后將PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄結果。

2.4 ALV-J-gp85 基因擴增克隆

2.4.1 ALV-J-gp85 基因PT-PCR 擴增

將2.1 中確定的ALV-J 陽性樣品用ALV-J-gp85 引物進行RT-PCR 擴增，反應體系：2×Taq MasterMix 25μl，ddH2O 17μl，cDNA 4.0μl，上游引物2μl，下游引物2μl，總體系50μl。反應條件：95℃5min；95℃30s，62℃退火30s，72℃1min，共進行35 個循環；72℃終延伸10min。反應結束后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4.2 ALV-J-gp85 基因的克隆及測序

將2.4.1 中ALV-J-gp85 RT-PCR 反應的產物經電泳后得到的條帶進行割膠后參照生工膠回收純化試劑盒說明書進行膠回收。并將其連接到pMD-19T 載體上，連接體系（10.0μl）：目的片段5μl、Solution I 4.5μl、pMD-19T 0.5μl，加完體系后瞬時離心混勻，放入金屬恒溫儀16℃連接過夜。把連接好的重組質粒轉入DH5α 感受態細胞后挑取單個菌落置于含氨芐抗性的液體LB 培養基過夜培養，用ALV-J-gp85 引物進行菌液PCR 擴增。菌液PCR 反應體系和程序同2.4.1，反應結束后將PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后將陽性重組質粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.5 ALV-J-gp85 基因序列分析

在GenBank 下載14 株ALV 各亞型毒株作為參考序列，將測序所得的ALV-J-gp85 基因序列利用DNAStar 軟件中的MegAlign 與下載的ALV 各亞型毒株的gp85 基因通過同源性和系統進化樹進行比對分析，參考序列信息見表3。

表3 ALV 參考毒株信息

3 結果與分析

3.1 ALV p27 抗原ELISA 檢測結果

由公式計算出樣品平均OD450nm 值≥0.3927 時判為陽性，由此判定出26 份血清ALV p27 均為陰性，陽性率0（0/26）。其中有一份高腳雞血清OD450nm 值為0.39，選擇這份血清進行后續試驗。

3.2 RT-PCR 擴增結果

根據RT-PCR 反應體系與條件，PCR 產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，ALV 通用引物在422bp 處出現特異性條帶，與預期相符合，見圖1。然后再將樣品用ALV-J-gp85 引物進行RT-PCR 擴增，PCR 產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品在931bp 左右出現條帶，與預期相符，見圖2。對該ALV-J-gp85 基因進行克隆和測序，并命名為GZAS20200701。

圖1 高腳雞ALV RT-PCR 檢測結果

3.3 同源性分析

利用生物學軟件Megalign 對該序列與從GenBanK 下載的14 株ALV 毒株進行同源性比對分析，結果如圖3 所示。其中同源性最高的為ALV-J 中的LYJ195 株，達99.5%（命名為：GZAS20200701），而與ALV-B 中的GD08 株同源性最低，為48.5%。序列與A、C、D、E、K 亞型的同源性在48.8%～50.8%之間，同源性較低。

圖3 ALV 毒株同源性分析結果

3.4 系統進化樹分析

根據GenBank 發布的序列，下載其中14 株ALV 毒株與序列（命名為：GZAS20200701）構建系統進化樹進行比對分析，結果如圖4 所示。該序列與ALV J 亞型中的LYJ15 株屬于同一分支，與LYJ195 株又同屬于另一個分支，說明該序列與LYJ15和LYJ195 毒株親緣關系較近，處于同一個分支。而與其他亞型的ALV 親緣關系較遠，處在2 個大的分支中關系最遠的分支。

圖4 ALV 毒株遺傳進化樹分析

4 討論與結論

我國幅員遼闊，地方雞品種豐富，高腳雞作為貴州地方品種，由于其獨有的風味、質量優異、價格合理等原因深受廣大消費者青睞，有廣闊的市場發展前景。但ALV 對養雞業的威脅仍然存在，且J 亞型的ALV 感染更為廣泛，我們應做好高腳雞凈化工作，以防ALV-J 傳播范圍擴大。未來應加強對高腳雞的監測，將樣本范圍和樣本量進行擴大，全面了解高腳雞感染禽白血病的狀況，做好禽白血病凈化的日常工作，將高腳雞地方品種優越性發揮出來，使高腳雞得到更好的發展。

試驗對26 份高腳雞血清進行ALV p27 抗原ELISA 檢測，ELISA 中并未檢測出陽性，但檢測結果中有一份非常接近陽性，將其提取RNA 進行反轉錄后用ALV-A/B/J 引物進行擴增，擴增出422bp 的條帶，與ALV-J 目的大小相符。說明該ALV p27抗原ELISA 檢測試劑盒與PCR 相比特異敏感性稍低。用ALV-J-gp85 引物對該樣品擴增出大小為931bp 左右的產物，將其克隆并命名為GZAS20200701。將GZAS20200701 與Gen-Bank 發布的 ALV -gp85 基因序列進行比對分析，GZAS20200701 與ALV-J 亞型的同源性為99.5%，說明本試驗從送檢的高腳雞血清樣本中擴增到的GZAS20200701 株屬于ALV-J。

20 世紀80 年代末期，自英國分離發現J 亞群禽白血病以來，該病毒在世界各地均有存在[7]。我國第一次發現ALV-J 是在20 世紀90 年代末，研究人員從肉雞體內分離得到，此后在山東、寧夏等多個省發現此病。隨著ALV 宿主范圍逐漸變大，不止在一些商品化蛋雞和地方品種雞中發現該病毒，在一些野鳥體內也發現了該病毒。gp85 基因在ALV-J 感染宿主細胞黏附和誘導機體產生特異性抗體中起重要作用，gp85 作為病毒囊膜蛋白表面的主要成分，gp85 含有的病毒-受體簇決定了病毒亞群的特異性及宿主范圍，整個gp85 基因也是高度可變的。因為病毒gp85 基因決定了病毒亞群的特異性，并編碼ALV 與受體決定因子結合形成決定簇，決定禽白血病病毒的宿主范圍，因此，通過檢測gp85 基因可以確定雞群是否感染ALV-J。Wang（2006）等 發 現，ALV-J gp85 基因在抗體選擇性壓力下會發生變化。ALV 是反轉錄病毒，env 基因的變異同時會導致ALV-J 毒株發生變異，而決定亞群特異性的gp85 序列由于存在高變區，很容易發生變異。2015年Dong 等發現鷓鴣小腿雞中存在ALV-J 感染，同時發現骨髓細胞瘤、骨髓瘤和纖維肉瘤[8]。2017 年Li 等發現，ALV-J 在感染個體之間會發生變化[9]。2019 年王元紅等在對一株J 亞型ALV gp85 基因序列進行分析，同時也預示ALV 的變異一直處于緩慢的演化[10]。目前，禽白血病病毒J 亞群依然對我國及世界各地養禽業造成重大威脅。本試驗為在分子水平方向深入研究ALV-J-gp85 基因奠定了一定的理論基礎，同時也提供一定的數據參考。