HPLC法測定患者血漿中達托霉素濃度

吳 瑕，劉秀菊，楊秀嶺，馬穎超，吳 迪（.河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000；.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000）

達托霉素是從發酵的鏈霉菌屬玫瑰色孢子中提取的具有獨特環狀結構的新型環脂肽類抗生素[1]，主要通過干擾細胞膜對氨基酸的轉運、阻礙細菌細胞壁的生物合成、改變細胞膜電位等多種機制破壞細菌細胞膜功能，從而對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌和耐萬古霉素腸球菌等革蘭陽性菌起到殺菌作用，治療成人復雜性皮膚及軟組織感染、菌血癥和心內膜炎[2]，是萬古霉素治療失敗的右心感染性心內膜炎的替代藥物[3]。

達托霉素主要以原型通過腎臟排泄，腎損傷時消除半衰期明顯延長，腎功能異常患者需調整給藥劑量[4]。達托霉素治療不同感染的給藥劑量存在差異，用于皮膚軟組織感染的劑量為4 mg·kg-1·d-1，治療菌血癥及感染性心內膜炎劑量為 6 mg·kg-1·d-1，《桑福德抗微生物治療指南》[5]推薦治療耐萬古霉素腸球菌感染劑量為8 ～ 12 mg·kg-1·d-1，不同給藥劑量導致穩態血藥濃度差異較大，且該藥具有潛在的肌肉毒性和腎毒性[6]，因此開展治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）可以為臨床安全用藥提供數據支持。國內外文獻報道中主要采用HPLC法測定發酵液、原料藥、制劑中的達托霉素濃度[7-11]，但檢測人血漿中藥物濃度的報道較少，本研究擬建立一種簡單快捷、經濟實用的HPLC法檢測患者血漿中達托霉素的濃度，旨為臨床患者進行TDM提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（配2489型紫外檢測器），Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；低溫冷藏箱（MDF-U2086S，日本三洋公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫科大學儀器廠）；高速離心機（離心半徑50 mm，美國ABBOTT）；冷藏柜（YC-180，澳柯瑪公司）；電子分析天平（CPA225D，德國Sartorius公司）；臺式酸度測定儀（pH 213，意大利HANNA公司）

1.2 試藥

達托霉素對照品（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：683190401RS，含量93.9%）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100142-201706，含量100.0%）；人血漿由河北省血液中心提供；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，批號：25962，分析純）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氫銨溶液（38∶62，v/v，pH = 3.5）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長214 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 達托霉素對照品儲備液取達托霉素2.13 mg精密稱定，置于5 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含達托霉素400 μg·mL-1的儲備液，置于4 ℃儲存備用。

2.2.2 卡馬西平對照品儲備液取卡馬西平1.25 mg精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解定容，配制成含卡馬西平50 μg·mL-1的儲備液，于4 ℃儲存備用。

2.3 血樣處理

在1.5 mL離心管中加入100 μL血漿及10 μL內標卡馬西平溶液，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進行分析。

2.4 方法專屬性考察

取人空白血漿、人空白血漿+達托霉素對照品、人空白血漿+達托霉素對照品+內標馬卡西平，渦旋混勻，分別按“2.3”項下方法處理后分析并記錄色譜圖。結果顯示達托霉素及內標卡馬西平峰形良好，與人空白血漿中內源物質分離良好，保留時間分別為10.19、15.84 min。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A - 人空白血漿，B - 人空白血漿+達托霉素，C - 人空白血漿+達托霉素+卡馬西平；1 - 達托霉素，2 - 卡馬西平Fig 1 HPLC chromatogramA - human blank plasma, B - human blank plasma + daptomycin, C -human blank plasma + daptomycin + carbamazepine; 1 - daptomycin,2 - carbamazepine

2.5 標準曲線與檢測限、定量下限

用50%甲醇溶液將達托霉素儲備液稀釋至不同濃度，分別取20 μL置于1.5 mL離心管中氮氣吹干，加入200 μL空白血漿及25 μg·mL-1內標卡馬西平溶液20 μL，制成80、40、20、10、5、2 μg·mL-1達托霉素血漿樣品，加入600 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋混合2 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液常溫氮氣揮干，加流動相200 μL復溶，取10 μL進行HPLC測定，記錄色譜圖。以待測物濃度（X）為橫坐標，待測物與內標物峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，得標準曲線方程：Y= 0.025 4X+ 0.059 9，r= 0.999 8，表明達托霉素在2 ～ 80 μg·mL-1范圍內線性關系良好，檢測限（S/N = 3）為0.5 μg·mL-1，定量下限（S/N = 10）為1 μg·mL-1。

2.6 精密度試驗

取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達托霉素血漿樣品各5份，在同一天內處理并分析，計算日內精密度；連續3 d處理并分析，計算日間精密度。結果顯示日內精密度RSD分別為3.58%、2.46%、5.37%，日間精密度RSD分別為4.16%、3.28%、6.50%。

2.7 回收率試驗

2.7.1 提取回收率取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達托霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后分析，測得的峰面積與相應濃度達托霉素對照品溶液直接進樣所得的峰面積之比為提取回收率，分別為96.4%、102.3%、99.9%，RSD分別為3.6%、6.1%、5.2%。制備卡馬西平血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后分析，內標峰面積與相應濃度的內標溶液直接進樣所得峰面積之比為內標的提取回收率，為94.7%，RSD為8.1%。

2.7.2 方法回收率取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達托霉素血漿樣品各5份，分別按“2.3”項下方法處理后分析，按標準曲線計算真實濃度，真實濃度與理論濃度之比為方法回收率，分別為89.4%、82.2%、87.6%，RSD分別為2.6%、4.2%、5.1%。

2.8 穩定性試驗

取人空白血漿，制備低、中、高（5、20、60 μg·mL-1）濃度達托霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后室溫放置0、1、2、4、12 h后進行分析，考察室溫放置穩定性。于-40 ℃冰箱低溫保存5 d，按相應方法處理后分析，考察低溫保存穩定性。反復凍融3次，按相應方法處理后分析，考察反復凍融穩定性。結果表明上述條件下樣品均穩定，RSD均< 10%。

2.9 方法學應用

選取6例使用了達托霉素的臨床患者（男性2例，女性4例），在血藥濃度達到穩態后，于次日給藥前30 min抽取靜脈血3 mL測定血藥濃度，濃度范圍為8.25 ～42.27 μg·mL-1，所建方法能夠滿足患者血漿中達托霉素濃度檢測要求。見表1。

表1 達托霉素血藥濃度測定結果Tab 1 Results of daptomycin blood concentration

3 討論

目前國內外已有LC-MS/MS法測定達托霉素血藥濃度的報道[12-14]，可以快速測定更低的藥物濃度。該藥屬于濃度依賴性抗生素，血藥峰濃度58 μg·mL-1[4]，血藥濃度決定抗菌療效，藥物濃度過低無法有效殺菌，因此低濃度的檢測價值有待考量；且LC-MS/MS成本昂貴，很多醫療機構未配備質譜儀，不利于TDM和臨床藥學服務的開展。本文建立了一種簡單、經濟的HPLC測定法，更適用于達托霉素的血藥濃度檢測和藥代動力學研究。

實驗過程中對比了乙腈-水、乙腈-醋酸銨、乙腈-磷酸鹽緩沖液等多種系統，參考相關研究[15]報道的乙腈-200 mmoL·L-1磷酸鹽緩沖液，但鹽溶液濃度過高容易堵塞色譜柱，最終選擇乙腈-100 mmoL·L-1磷酸二氫銨（pH = 3.5）作為流動相。實驗采用50%甲醇溶液配制達托霉素工作液，防止玻璃器皿和聚丙烯試管對藥物的吸附[16]，降低實驗誤差。

達托霉素具有水溶性、分子量大、表觀分布容積小（約0.1 L·kg-1）等藥代動力學特點，主要分布于血漿和間質液中，與血漿白蛋白廣泛可逆性結合（血漿蛋白結合率90% ～ 93%），當患者處于重癥感染、低蛋白血癥、循環血量變化等特殊病理生理狀態下，表觀分布容積明顯增加[4]，易造成血藥濃度波動大。一項在重癥患者中進行的PK/PD研究證實，治療MIC≥1 mg·L-1的細菌感染，當肌酐清除率> 60 mL·min-1或肌酐清除率較低但接受連續腎臟替代治療時，給予4 mg·kg-1·d-1和6 mg·kg-1·d-1標準劑量有效達標率較低，需增加給藥劑量，TDM可協助臨床優化給藥劑量，提高抗感染療效[17]。本研究采用所建方法測定了6例臨床患者的達托霉素血藥濃度，檢測結果在研究線性范圍內，方法準確精密、操作簡便，滿足TDM的要求，可為臨床安全、有效用藥提供參考。