雷帕霉素對心肌缺血再灌注損傷大鼠細胞間黏附分子1 的影響

張新圖，肖輝

(1.湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院/湖南省直中醫醫院藥學部，湖南 株洲 412000；2.湖南中醫藥大學附屬第一醫院藥學部，湖南 長沙 410007)

0 引言

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是伴隨于缺血性心臟病的病理生理過程，其受損程度可影響病情的預后，當前臨床上尚缺乏針對心肌缺血再灌注損傷的有效治療手段。雷帕霉素(rapamycin)為新型大環內酯類抗生素，常用于治療自身免疫性疾病及器官移植排斥反應[1,2]；近年有報道稱，雷帕霉素對心肌缺血再灌注損傷動物具有保護作用[3]。本研究通過制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，進一步探索雷帕霉素的心肌保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD 大鼠，清潔級，♀♂各半，體重(180±20)g，由武漢生物制品研究所有限責任公司實驗動物室提供，所有動物相關操作均經本單位動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑

雷帕霉素，美國Sigma 公司，臨用前用0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium salt, CMC-Na) 配制。氯化硝基四氮唑藍(nitro blue tetrazolium chloride, NBT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 試劑盒，南京建成生物工程研究所。細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

生物顯微鏡，日本Olympus 公司；自動勻漿機，金瑞鴻捷公司；冷凍離心機，德國Hettich 公司；醫學影像分析系統，北京眾實迪創公司；紫外可見分光光度計，美國Thermo 公司；十二導聯心電圖機，日本Nihon 公司；小動物人工呼吸機，安徽正華公司。

2 實驗方法

2.1 心肌缺血再灌注損傷模型的制備

參照文獻[4]，行冠脈結扎術。簡言之，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，仰位固定于手術臺，頸部備皮、分離氣管，連接小動物人工呼吸機以輔助呼吸，四肢連接十二導聯心電圖機以監測心電圖；將左胸第3、4 肋骨處備皮、分離筋肉，將肋骨間隙撐大以暴露心臟，取縫合線穿過左冠脈前降支的起始部，于縫合線和冠脈間墊一軟管，將縫合線結扎以使心肌進入缺血狀態，最后將心臟納回原處；約30min 左右可見心電圖ST 段或T 波明顯抬高，繼而松開冠脈結扎處再灌注2h，可見抬高的ST 段或T 波明顯下降。假手術組大鼠開胸但不結扎冠脈，余操作同上。

2.2 分組治療

將30 只大鼠隨機分3 組(n=10)：模型組(等體積溶媒)、雷帕霉素組(5mg/kg)、假手術組(等體積溶媒)。造模前1 周開始灌胃給藥(體積按10 mL/kg)，每天1 次。

2.3 心肌梗死率的測算

再灌注結束后，動物處死，取心臟，清洗后，從心尖起將左心室平行切片，置于0.1% NBT 染色液15min，拍攝圖像并通過ImagePro 軟件分別測量心肌梗死區面積和心室總面積，計算心肌梗死率(%)。

2.4 檢測心肌MPO 活力

取部分洗凈的心臟，勻漿，低溫離心10min(3500r/min)后取上清，上紫外可見分光光度計比色法測定光密度(OD)值，并按說明書規程計算MPO 活力(U/g)。

2.5 檢測心肌組織ICAM-1 表達

取部分洗凈的心臟，固定于4%多聚甲醛液，按免疫組化說明書規程，常規脫水、包埋、切片、封片，采集圖像，導入醫學影像系統進行分析，ICAM-1 陽性表達以積分光密度(IOD)值表示。

2.6 統計學分析

3 實驗結果

3.1 雷帕霉素對心肌梗死率的影響

假手術組大鼠心肌未見梗死，模型組心肌梗死率37.92%，雷帕霉素組可使心肌梗死率降低至31.99%，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌梗死率比較(± s, n = 10)

3.2 雷帕霉素對中性粒細胞浸潤的影響

模型組動物心肌MPO 活力顯著升高至425.70 U/g，與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.01)；雷帕霉素組心肌MPO活力明顯降低至332.69 U/g，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，提示雷帕霉素可減輕中性粒細胞浸潤程度，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌MPO 活力比較(± s, n = 10)

3.3 雷帕霉素對心肌ICAM-1 表達的影響

假手術組心肌組織ICAM-1 表達極低，模型組動物心肌 組 織ICAM-1 表 達 則 明 顯 升 高(IOD 值：24.93 ± 4.98)，組間差異有統計學意義(P＜0.01)；與模型組相比，雷帕霉素組可顯著降低心肌組織ICAM-1 表達(IOD 值：17.06 ±4.17)(P＜0.01)，見圖3。

圖3 各組大鼠心肌ICAM-1 表達比較(±s, n = 10)

4 討論

心肌缺血再灌注損傷仍缺乏行之有效的防治方法，目前其治療措施主要有：①模擬內源性保護劑；②清除氧自由基；③抗細胞凋亡；④減輕細胞內Ca2+超載；⑤抑制炎癥反應；⑥缺血預處理(ischemic preconditioning，IP)等。缺血預處理使人們對器官保護產生了新的認識，但往往因倫理問題而難以在臨床上推廣開來。近年來有學者提出藥物預處理(pharmacological preconditioning，PP)的新策略，通過藥物預處理，提前激活內源性保護途徑，抑制機體內源性毒性物質的產生，阻斷繼發性損傷的級聯反應，或促進機體釋放生物活性物質，以增強心肌對缺血再灌注損傷的耐受[5,6]，這對探索心肌缺血再灌注損傷的臨床治療方法具有重要意義。本研究采用心肌缺血再灌注損傷發生前1 周口服雷帕霉素的預處理方式，結果表明雷帕霉素能顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死率，提示雷帕霉素具有心肌保護作用。

炎癥反應是缺血再灌注引發間接損傷的重要病理特點之一，主要表現為炎癥細胞( 如中性粒細胞) 聚集浸潤、多種炎性細胞因子和黏附分子過度表達等[7]；抑制炎癥反應可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的有效手段[8]。心肌缺血再灌注損傷發生時炎癥細胞因子被激活，誘導大量的炎性細胞黏附于血管內皮細胞，進而促使蛋白水解酶、氧自由基、收縮血管因子等參與心肌缺血再灌注損傷進程，缺血區的炎癥細胞則同時分泌大量的細胞因子及炎癥介質，如白介素(interleukin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B)、MPO 等，這些因子誘導缺血區內皮細胞表達更多的細胞間黏附分子1(ICAM-1)、P 選擇素及E 選擇素等，進而介導中性粒細胞黏附于內皮細胞并浸潤到心肌組織，既可影響凝血系統減少血供，又可釋放蛋白水解酶破壞血管壁的完整性，造成心肌細胞受損或其功能降低[9-11]。研究證實，大鼠缺血心肌組織中性粒細胞數量明顯比正常心肌組織高，并可在再灌注2 h 時達到最高點[12]；而抑制中性粒細胞活化及浸潤則可減輕心肌受損程度[13]。本研究結果表明，再灌注2 h 后中性粒細胞標志物MPO 酶活力明顯增高，提示中性粒細胞的浸潤嚴重，雷帕霉素預處理可使心肌MPO 酶活力顯著降低(P＜0.01)，表明雷帕霉素可通過減少中性粒細胞活化，抑制其浸潤，實現心肌保護作用。

黏附分子ICAM-1 為免疫球蛋白超家族成員之一，又稱CD54，體內存在于多種細胞表面，介導細胞間的黏附作用；ICAM-1 在正常心肌細胞表面僅有微量表達，當心肌缺血再灌注發生時在細胞因子(NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α 等)的誘導下會過量表達，與淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1) 及巨噬細胞活化趨化因子-1(Macrophage activation chemokine 1)結合，參與炎癥級聯反應[14]。在ICAM-1 介導下，可促使血液中白細胞激活和血管內皮細胞活化，大量白細胞遷移、積聚到心肌缺血區，進而與血管內皮細胞黏附，這些白細胞可活化血小板及凝血系統，引起血栓形成和微循環不暢，減少缺血區的血供；同時本身又會釋放多種蛋白水解酶、過氧化物、炎癥介質等，蛋白水解酶可解離血管內皮細胞和基底膜細胞，破壞血管壁的完整性，使炎癥細胞容易通過并聚集到缺血區，過氧化物和炎癥介質可進一步損傷心肌細胞，造成心肌缺血再灌注損傷的加重[15]。據報道，實驗動物心肌組織中性粒細胞浸潤數量與ICAM-1的表達呈現顯著的正相關[16]。本研究結果表明，再灌注2 h后心肌ICAM-1 表達明顯增高，提示ICAM-1 的高表達參與了缺血再灌注損傷的病理進程，這與上述報道結果類似；雷帕霉素組心肌ICAM-1 表達明顯降低(P＜0.01)，提示雷帕霉素可通過抑制ICAM-1 表達，減少中性粒細胞等炎性細胞在缺血區的黏附及浸潤，緩解了心肌缺血區的炎癥反應。

總之，雷帕霉素預處理可保護心肌缺血再灌注損傷大鼠的受損心肌組織，其作用機制可能與減少中性粒細胞浸潤、抑制黏附分子ICAM-1 高表達、緩解炎癥反應等有關。