蠟樣芽孢桿菌YB1對大菱鲆幼魚生長性能、腸道消化酶、肝臟抗氧化酶及腸道組織結構的影響*

崔廣鑫 孫 娜 王騰騰 陳鈺臻 韓慧宗 ① 姜海濱

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環境研究院山東省海洋生態修復重點實驗室 山東 煙臺 264006)

益生菌是一類有益活性微生物的統稱，是海水養殖病害生物防控的重要手段，在改善養殖生物腸道菌群結構、促進生物對飼料的消化吸收、提高宿主免疫力、增強機體抗病力等方面表現出較好的效果(Lakshmi et al, 2013; Madani et al, 2018)，可作為養殖生產中抗生素類藥物的理想替代品(薛俊敬, 2018;Pandiyan et al, 2013)。芽孢桿菌是研究較多的益生菌種之一，主要包括枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、凝結芽孢桿菌(B. coagulans)等，其被廣泛應用于大菱鲆(胡凡光等, 2014)、大瀧六線魚(Hexagrammos otakii) (樊英等, 2021)、菲律賓鰻鱺(Anguill marmorata) (姚清華等, 2016)和尖吻鱸(Lates calcarifer)(袁豐華等, 2010)等魚類養殖中。但關于蠟樣芽胞桿菌在水產養殖中的應用研究相對較少，Catesoupe(1999)研究表明，蠟樣芽孢桿菌進入宿主體內能夠迅速定殖，并可通過產生蛋白酶和淀粉酶等大分子物質提高宿主的消化機能，促進營養物質的消化吸收。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)于 1992年引入我國，因其具有生長迅速、肉質鮮美、易于飼養等特點(雷霽霖, 2000)，現已成為我國北方工廠化養殖的重要經濟海水魚類(路晶晶等, 2018; 樊瑞鋒等, 2011)。近年來，隨著養殖規模不斷擴大、集約化程度不斷提高，大菱鲆養殖環境惡化、病害頻發等問題突出。抗生素類藥物的使用有效解決了養殖過程中的病害問題，但長期使用會導致病原菌耐藥性、藥物殘留以及水環境污染等問題，嚴重制約了大菱鲆養殖產業的健康發展。研制綠色、安全的抗生素替代品成為大菱鲆養殖產業高質量發展的必然趨勢。本課題組研究發現，蠟樣芽胞桿菌 YB1在一定濃度內對大菱鲆具有動物安全性，可作為益生菌的候選菌株(孫娜等,2019)。目前，關于蠟樣芽胞桿菌應用于大菱鲆養殖中的研究尚未見報道。本研究將本課題組篩選的蠟樣芽胞桿菌 YB1添加到飼料中，探討其在大菱鲆養殖過程中對魚體生長性能、腸道消化酶及肝臟抗氧化酶活力、腸道組織結構的影響，以期為大菱鲆健康養殖和疾病的生態防控提供新的益生菌種。

1 材料與方法

1.1 蠟樣芽孢桿菌制劑的制備及飼料配制

實驗所用蠟樣芽胞桿菌YB1 (由本實驗室篩選、保存)活化后接種于LB液體培養基，37℃、200 r/min振蕩培養 24 h后，6000 r/min離心收集菌體，使用PBS緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]重懸獲得原菌液，其活菌含量為1×1010CFU/mL。使用PBS稀釋原菌液以噴霧形式均勻添加至基礎飼料(購于山東升索飼料科技有限公司)表面，陰涼處風干，涂布含YB1的飼料于LB固體培養基，檢測飼料中YB1的含量分別為 0、105、106和 107CFU/g。

1.2 實驗設計及飼養管理

實驗所用大菱鲆幼魚共計 720尾(購于煙臺泰華海洋科技有限公司)，其種質來源相同、大小均勻、體質健壯、平均體質量為(3.6±0.7) g。實驗開始前，將幼魚置于0.6 m3水體的實驗桶中暫養1周。暫養結束后，將實驗用魚隨機分為4組，分別命名為D-C組(含菌量 0 CFU/g)、D-E-L 組(含菌量 105CFU/g)、D-E-M 組(含菌量106CFU/g)和D-E-H 組(含菌量107CFU/g)。每組設置3個平行，每個平行60尾，各平行之間幼魚體質量基本保持一致。每日早、中、晚共投喂3次，日投喂量約占大菱鲆幼魚體質量的2%～4%，以飽食為準，及時清理糞便和殘餌。實驗期間控制水溫為(21±2)℃，鹽度為28～32，pH為7.9～8.2，溶氧＞5 mg/L，氨氮＜0.01 mg/L，養殖周期為 50 d。

1.3 樣品采集及處理

1.3.1 大菱鲆幼魚生長指標的測定 在0、25和50 d分別對各組實驗用魚的體質量進行測量，測量前停食24 h，測量后計算平均體質量、增重率(WGR)、特定生長率(SGR)和飼料系數(FCR)。

式中，t為飼養時間，W0為平均每尾大菱鲆幼魚初始體質量，Wt為平均每尾大菱鲆幼魚終末體質量，It為平均每尾大菱鲆幼魚攝食飼料總質量。

1.3.2 腸道消化酶活力的測定 在第 25和50天時，隨機從各實驗組的每個平行中取3尾大菱鲆幼魚測定腸道酶活力，取樣前停食24 h。取樣時于冰盤上解剖大菱鲆，取出腸道后用滅菌水沖洗干凈，裝入凍存管迅速置于液氮中冷凍保存、待測。腸道蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)均采用南京建成試劑盒測定，其中，組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法，蛋白酶和脂肪酶采用比色法，淀粉酶采用碘—淀粉比色法。

1.3.3 肝臟抗氧化酶活力的測定 在第25和50天時，隨機從各實驗組的每個平行中取3尾大菱鲆幼魚測定肝臟酶活力，取樣前停食24 h。取樣時，于冰盤上解剖大菱鲆，取出肝臟后用滅菌水沖洗干凈，裝入凍存管，迅速置于液氮中冷凍保存、待測。肝臟超氧化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase, SOD)、 丙 二 醛(malondialdehyde, MDA)和過氧化氫酶(catalase, CAT)均采用南京建成試劑盒測定。其中，肝臟SOD酶活力測定采用WST-1法，MDA含量測定采用TBA法，CAT酶活力測定采用紫外法。

1.3.4 腸道組織結構的觀察 在 0、25和 50 d 時，隨機從各實驗組的每個平行中取3尾大菱鲆幼魚，分析腸道組織結構。取樣前停食24 h，解剖大菱鲆，剪取前腸段用滅菌水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分后置于波恩氏液中固定 24 h，用 70%乙醇多次清洗至樣品無黃色。固定好的腸道組織經脫水、浸蠟，包埋于石蠟中，用切片機切片；切片烘干后置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇溶液洗脫；蘇木精染色，伊紅復染，洗去浮色后封片、烘干，顯微鏡下觀察腸道組織結構。

1.4 數據處理

使用Excel軟件進行數據統計，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，通過Duncan多重比較檢驗各組數據差異顯著性，差異顯著水平設置為P＜0.05，結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 YB1對大菱鲆幼魚生長性能的影響

在飼料中添加蠟樣芽胞桿菌 YB1對大菱鲆幼魚WGR、SGR和FCR的影響見表1。由表1可知，實驗前期(0～25 d)，僅D-E-M組WGR和SGR高于D-C組，D-E-L組、D-E-M組和D-E-H組的FCR均高于D-C 組，但無顯著差異(P＞0.05)。實驗末期(25～50 d)，各實驗組的WGR和SGR均高于對照組，其中D-E-H組最高，與對照組相比WGR和SGR分別提高了27.78%和 21.39% (P＜0.05)。整個實驗周期(0～50 d)，D-E-L組、D-E-M組和D-E-H組的WGR和SGR均高于D-C組，其中D-E-H組最高，較D-C組分別提高了13.91%和7.98%，且與D-C組具有顯著差異(P＜0.05)，D-E-L組、D-E-M 組和 D-E-H 組的 FCR均稍高于D-C組，但與D-C組無顯著差異(P＞0.05)。

表1 飼料中添加蠟樣芽胞桿菌YB1對大菱鲆幼魚生長性能的影響(平均值±標準差, n=3)Tab.1 Effects of dietary B. cereus YB1 on growth performance of juvenile S. maximus (Mean±SD, n=3)

2.2 YB1對大菱鲆幼魚腸道消化酶活力和肝臟抗氧化酶活力的影響

飼料中添加 YB1對于大菱鲆幼魚腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力和肝臟丙二醛含量、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力的影響見表2。由表2可知，實驗前期(0～25 d)，D-E-L組、D-E-M組和D-E-H組的腸道蛋白酶活力和淀粉酶活力均高于D-C組，但各組間無顯著性差異(P＞0.05)；D-E-M組的脂肪酶活力最高，且顯著高于D-C組(P＜0.05)；D-E-L組、D-E-M組和D-E-H組的肝臟SOD活力均高于D-C組，D-E-L組和D-E-H組的CAT活力均高于D-C組，各實驗組的MDA含量均顯著低于對照組(P＜0.05)。

表2 飼料中添加蠟樣芽胞桿菌YB1對大菱鲆幼魚腸道消化酶和肝臟抗氧化酶活力的影響Tab.2 Effects of dietary B. cereus YB1 on intestinal and liver enzyme activity in juvenile S. maximus

實驗末期(25～50 d)，D-E-M組腸道蛋白酶和淀粉酶活力最高，且顯著高于D-C組(P＜0.05)，D-E-L組的脂肪酶活力最高，且顯著高于D-C組(P＜0.05)；各實驗組的肝臟MDA含量均低于對照組，其中D-E-M組的 MDA含量最低，且與 D-C組存在顯著性差異(P＜0.05)，D-E-H組的SOD和CAT活力最高，但各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 YB1對大菱鲆幼魚腸道組織結構的影響

飼料中添加 YB1可以增加大菱鲆幼魚腸粘膜皺襞高度、肌層厚度以及腸道褶皺數量，顯著改善幼魚腸道組織結構。實驗結果顯示，各組大菱鲆幼魚腸道黏膜組織清晰，結構完整，排列有序，無混亂、脫落的現象(圖1)。由表3可知，整個實驗周期，25 d和50 d實驗組大菱鲆幼魚腸道黏膜皺襞高度、肌層厚度和腸道褶皺量與第0天相比顯著增加；25 d時，D-E-L組和D-E-M組的腸黏膜皺襞高度、肌層厚度較 D-C組顯著增加(P＜0.05)，D-E-L組、D-E-M組和D-E-H組的腸道褶皺量均較D-C組顯著增加(P＜0.05)；50 d時，各實驗組的腸黏膜皺襞高度、肌層厚度和腸褶皺量顯著高于對照組(P＜0.05)。

表3 蠟樣芽孢桿菌YB1對大菱鲆幼魚腸道組織結構的影響Tab.3 Effects of B. cereus YB1 on the intestinal structure of juvenile S. maximus

圖1 蠟樣芽孢桿菌YB1對大菱鲆幼魚腸道組織結構的影響Fig. 1 Effects of B. cereus YB1 on the intestinal structure of juvenile S. maximus

3 討論

3.1 YB1對大菱鲆幼魚生長性能的影響

目前，益生菌已被廣泛應用于水產養殖行業(Pandiyanet al, 2013)，如芽孢桿菌能夠促進珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)生長，提高其免疫力和抗氧化能力(王成強等, 2019)；乳酸菌可提高許氏平鲉(Sebastes schlegelii)的免疫力，促進其生長(王騰騰, 2017)；解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)能提高黑鯛(Sparus macrocephalus)的 WGR 和 SGR (覃初斌等, 2017)。本研究中，飼料中蠟樣芽胞桿菌YB1的添加量為107CFU/g時，可顯著提高大菱鲆幼魚WGR和SGR，YB1應用于大菱鲆幼魚養殖可起到促進生長的良好效果。此外，益生菌的使用要求適宜的添加量，添加量太低達不到相應的益生效果，添加量太高則會破壞養殖生物的腸道菌群結構(Panigrahiet al, 2004)。益生菌的具體添加量尚未形成統一的標準，多由研究者根據實際情況針對不同的研究對象探索最適添加量，例如，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)最適宜的芽孢桿菌添加量為 109CFU/kg (王苓等, 2017)；枯草芽孢桿菌的添加量為 1.2×104CFU/g 時，仿刺參(Apostichopus japonicus)的SGR提高最顯著，但當添加量為1×104CFU/g時，蛋白酶活力提高了53.93%，而脂肪酶活力無顯著性提高(董春光等, 2015)。本研究中，蠟樣芽胞桿菌 YB1的添加量為107CFU/g時，可顯著提高大菱鲆幼魚的WGR和SGR。因此，益生菌添加量的確定應綜合考慮養殖對象、益生菌種類以及應用目標等因素。

3.2 YB1對大菱鲆幼魚腸道消化酶和肝臟抗氧化酶活力的影響

腸道中消化酶活力的高低是魚類飼料吸收轉化率和養殖效率的主要影響因素，芽孢桿菌進入魚類腸道后能迅速定植，提高相應的消化酶活力，促進機體對營養物質的消化吸收(程遠等, 2014)。姚清華等(2016)發現，在飼料中添加 2.5% (5×108CFU/g)枯草芽孢桿菌可顯著提高黑仔期菲律賓鰻鱺(Anguill marmmorata)腸道淀粉酶、蛋白酶以及脂肪酶的活力。付保榮等(2018)研究認為，短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)可 顯 著 提 高 鯉 魚 (Cyprinus carpio)腸道蛋白酶和淀粉酶的活力。Sun等(2010)研究表明，飼料中添加嗜冷芽孢桿菌(Psychrobactersp)可提高點帶石斑魚(Epinephelus coioides)腸道內蛋白酶、淀粉酶以及脂肪酶的活力，但與對照組無顯著差異。本研究中，投喂含有YB1飼料的大菱鲆幼魚腸道消化酶活力與對照組相比在實驗前期有升高的趨勢；實驗末期，YB1添加量為105CFU/g組的幼魚腸道內脂肪酶活力顯著高于對照組，添加量為106CFU/g時，淀粉酶和蛋白酶活力顯著高于對照組。本課題組前期研究發現，YB1具有產淀粉酶和蛋白酶的特性(孫娜等, 2019)，實驗組大菱鲆幼魚腸道內消化酶活力的提高可能與YB1定植于幼魚腸道后分泌的胞外酶有關，淀粉酶、蛋白酶等胞外酶能夠協助機體消化營養物質，促進飼料中營養素的降解，提高飼料利用率。

魚類的抗氧化防御系統能夠清除體內過量的氧自由基，減少活性氧對機體的損傷(Sakai, 1999)，SOD是機體內一種重要的抗氧化酶，可通過清除機體內氧自由基參與機體的抗氧化防御過程；CAT則可參與活性氧的代謝過程，保護細胞免受損傷；MDA含量可反映機體內氧化反應對細胞的損傷程度(李雅琴等,2015; 張坤生等, 2007; 孔祥會等, 2007)。本研究中，YB1添加量為107CFU/g組的大菱鲆幼魚肝臟SOD活力較對照組增加了23%，且幼魚肝臟內CAT活力相較于對照組有顯著提高；在同一添加量下，幼魚的WGR和SGR也處于較高的水平。這說明，在飼料中添加適量的 YB1能提高大菱鲆體內抗氧化酶活力，維持其抗氧化系統的平衡，在一定程度上提高幼魚的抗氧化能力和生長性能。黃坤鵬等(2012)研究也發現，芽孢桿菌可顯著提高斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)仔魚體內的SOD活力。袁衛(2016)研究表明，飼料中添加芽孢桿菌在提高凡納濱對蝦體內抗氧化活性指標的同時，對其生長也有一定的促進作用。MDA是脂類物質參與生物體內氧化反應的最終產物，其含量的高低可作為衡量生物體內抗氧化系統能否正常發揮作用的指標(李盈鋒等, 2014)。本研究發現，實驗組大菱鲆幼魚肝臟MDA含量顯著低于對照組，YB1添加量為107CFU/g時，MDA含量下降了42%。這表明芽孢桿菌對大菱鲆幼魚體內的抗氧化能力產生了積極的影響，但其對抗氧化系統的具體益生機制仍待進一步研究。

3.3 YB1對大菱鲆幼魚腸道組織結構的影響

魚類腸道由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層4部分構成(賴紅娥, 2013)，黏膜層是腸道進行營養物質消化吸收和腸道菌群黏附的主要場所，腸道肌層可為腸道蠕動提供充足的動力，促進營養物質吸收，因此，通過觀察黏膜層和肌層的結構變化可直觀的了解益生菌在腸道中發揮的作用。黃靈等(2018)研究表明，飼料中添加益生菌微生態制劑可提高虎龍斑(Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂)腸道絨毛密度和高度。徐晨等(2018)研究發現，生物絮團養殖模式下添加益生菌可顯著提高異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)腸道肌層厚度和黏膜下層厚度。本研究發現，與對照組相比，飼料中YB1添加量為106CFU/g時，大菱鲆幼魚腸道黏膜皺襞高度、肌層厚度和腸道褶皺數量分別提高了48.85%、48.47%和68.91%。宿主腸道組織結構的改善可能與微生物分泌的一些次生代謝產物或生物活性物質有關，如枯草芽孢桿菌代謝產生的表面活性素可影響腸道細胞膜結構；丁酸梭菌(Clostridium butyricum)分泌的丁酸可促進腸道細胞的增殖，凝結芽孢桿菌代謝產生的乳酸對生物腸道的蠕動和腸黏膜細胞的增殖具有促進作用(樊英等,2019)。本研究中，YB1對大菱鲆幼魚腸道組織結構的改善作用，可能與其分泌的一些活性物質對腸道黏膜細胞的促進作用有關，但具體的作用機制仍需進一步研究。