飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)對大黃魚抗氧化能力和肌肉品質的影響*

孟 偉 王 琦 牟 華 鞏 雨 申雅雯 孫云霞 張文兵 麥康森

(農業農村部水產動物營養與飼料重點實驗室 海水養殖教育部重點實驗室中國海洋大學水產學院 山東 青島 266003)

魚油因富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等必需脂肪酸，并具有良好的適口性而被廣泛用作海水養殖魚類飼料的重要脂肪源。隨著集約化養殖對魚油的大規模需求，野生漁業資源的減少及環保意識的增強，用于生產魚油的原料供給緊張，致使魚油價格持續上漲。因此，產量大、價格低的植物油越來越受到人們的重視(FAO, 2019)。棕櫚油是世界產量最大的食用植物油源，2018年全球棕櫚油產量為7 499.8萬 t (USDA, 2019)。棕櫚油含有飽和脂肪酸(SFA)和不飽和脂肪酸(UFA)的比例接近1∶1，其主要成分為棕櫚酸(C16:0)(Edem, 2002)。Bell等(2002)和 Fonseca-Madrigal等(2005)研究表明，棕櫚油分別替代0、25%、50%和100% 飼料魚油，對大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的生長性能無顯著影響，并且飼料棕櫚油最高含量分別可達24%與20%。

飼料脂肪源的改變會對養殖魚類肌肉品質產生影響。植物油完全替代飼料魚油顯著降低了大西洋鮭的肌肉質地、持水力和肉色(Regost et al, 2004)。魚肉口感是消費者評價魚類品質的常用標準，很大程度上決定其市場接受度。李百安(2015)、張殿福等(2020)從大西洋鮭和羅非魚(Oreochromismossambicus)等魚類的研究發現，肌肉的化學物質組成對衡量品質會產生重要影響。其中，肌肉中多不飽和脂肪酸(PUFA)易被氧化出現瘦背肌癥，進而造成肌肉品質下降(蘇小鳳等, 2002)。魚體過多的活性氧(ROS)造成機體氧化損傷，而氧化損傷的減弱與機體抗氧化能力的提升有關(Chen et al, 2013)。同時，ROS水平升高導致肌肉纖維直徑減小，增加肌肉硬度，對肌肉質構有調節作用(Yu et al, 2020)。程民杰(2014)研究表明，飼料中32%～40%的棕櫚油替代魚油可以提高半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)抗氧化能力并促進其生長，而飼料棕櫚油完全替代魚油則顯著降低抗氧化酶的活力，魚體合成能力降低，蛋白質效率降低。在虹鱒和大西洋鮭研究中發現，飼料中超過50%的魚油被棕櫚油替代會顯著降低魚體 n-3 PUFA 的含量(Fonseca-Madrigal et al, 2005)。

大黃魚(Larmichthys crocea)是我國最大規模的海水網箱養殖魚類。隨著養殖規模的擴大和養殖密度的增加，養殖大黃魚的品質備受關注。與野生大黃魚相比，養殖大黃魚出現肌肉松散、體色退化等品質問題(孟玉瓊等, 2016; Mu et al, 2017)。大黃魚養殖過程中，以投喂冰鮮雜魚為主，其來源不詳，品質不一，容易造成資源浪費、水環境污染和品質下降等問題(胡兵,2015)，這也促進了大黃魚環境友好型高效配合飼料的研發和應用。本研究以棕櫚酸替代飼料中不同水平的EPA+DHA，探究其對大黃魚肌肉品質和抗氧化能力的影響，為大黃魚配合飼料配方的優化提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉和豆粕為主要蛋白源，DHA富含油、EPA富含油、棕櫚酸以及卵磷脂為主要脂肪源，配制棕櫚酸/(EPA+DHA)比例分別為 1∶5、1∶1和 5∶1的 3種等氮(約 43%粗蛋白)、等脂(約11%粗脂肪)飼料，并分別命名為 P0、P50和 P100 (表 1)。

1.2 攝食生長實驗

實驗所用同一批大黃魚購于福建寧德市富發水產有限公司。在正式實驗開始前，先將大黃魚在4.0 m×4.0 m×4.0 m 的海水浮式網箱中馴養 14 d，以適應實驗飼料和養殖環境。暫養結束后，將魚饑餓24 h后，挑選體格健壯、大小相近的大黃魚[初始體重為(30.51±0.16) g]隨機分配到9個網箱(1.0 m×1.0 m×2.0 m)中，每個網箱 50尾。每種飼料隨機投喂3個網箱，每天飽食投喂2次(05:00和17:00)。養殖實驗周期為70 d。養殖期間，水溫為21℃～28℃，鹽度為 28～32，溶解氧(DO)≥6.5 mg/L。

養殖實驗結束后，大黃魚饑餓24 h，并使用丁香酚(1∶10 000)(純度為99%)對實驗魚進行麻醉。對每個網箱中的魚稱重和計數，分別記錄其體重和體長。在每個網箱隨機取9尾魚，收集肌肉樣本。為了避免肌肉的異質性，對特定的肌肉部位進行不同品質指標的測定[圖1，引自孟玉瓊等(2016)]。解剖后于48 h內完成測定肌肉質地、持水力和pH，其他肌肉樣品放入-80℃冰箱中冷凍保存。

圖1 大黃魚肌肉品質指標測定部位分布Fig. 1 Sampling segments for measurements of the quality parameters in muscle of large yellow croaker

1.3 樣品分析

1.3.1 肌肉脂肪酸的測定 稱取約 10 g 大黃魚肌肉D區(圖1)的樣品，切碎混勻之后，在冷凍干燥機(ALPHA1-4LD，Christ，德國)中凍干。脂肪酸甲酯化前處理后(孟玉瓊等, 2016)，采用氣相-質譜聯用儀進行檢測(GCMS-QP2010，島津，日本)(Muet al, 2018)。對色譜數據進行定性處理，通過NIST08.LIB譜庫進行檢索，確定脂肪酸組成(匹配度高于80%)。

1.3.2 肌肉質地、pH和持水力的測定 在肌肉 A區(圖1)選取3個點，采用質構儀(TMS-PRO，FTC，美國)中的TPA模式進行肌肉質地的測定，包括硬度、彈性、內聚性、粘附性和咀嚼性。相關參數：直徑為8 mm的圓柱形探頭；量程為25 N的力量感應元；檢測速度為 30 mm/min；形變量為 30%；起始力為 0.1 N。

采用Gómez-Guillén等(2000)的方法測定大黃魚肌肉B區(圖1)的持水力。使用便攜式pH計(Testo 205，德國)對大黃魚肌肉特定部位的3個點進行pH測定。

1.3.3 抗氧化相關基因的表達量分析 使用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, 美國)提取肌肉組織RNA。采用 NanoDrop 2000分光光度計(Thermo fisher scientific, 美國)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質量。按照說明書步驟操作，采用PrimeScriPtTMRT試劑盒(TaKaRa)將提取的RNA反轉錄成cDNA。

引物設計與合成：在NCBI上搜索已報道的大黃魚中相關目的基因的蛋白編碼的序列；對所找到的序列進行多重序列比對并確定合適的保守區；基于研究，選用β-actin為內參基因，應用Primer 5.0軟件設計、分析引物，并對引物進行修飾(降低簡并度)，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成并測試引物序列(表2)。

表2 抗氧化相關基因引物序列Tab. 2 Primer sequences of anti-oxidation related genes

PCR擴增反應：RT-PCR擴增反應體系試劑2 × EsTaqMasterMix 為 7.5 μL，上游引物(F, 10 μmol/L) 為0.3 μL，下游引物(R, 10 μmol/L)為 0.3 μL，dH2O 為5.9 μL，模板cDNA為1.0 μL。PCR反應均在Eppendorf Mastercycler gradient PCR 儀(德國)中進行。

數據處理：Nrf2、SOD和CAT表達量采用2-ΔΔCt法計算(Livaket al, 2001)。

1.3.4 抗氧化酶活性、總抗氧化力和丙二醛含量的測定 制備肌肉組織勻漿液后(Muet al, 2018)，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒分別測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量，采用比色法測定上述參數，使用紫外分光光度計(UV2401PC，島津，日本)測定吸光度。

1.4 統計分析

使用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析。所有數據均進行單因素方差分析(one-way ANOVA)后，若組間存在顯著差異則采用Duncan’s檢驗進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 生長性能

從圖2可以看出，P0、P50和P100組之間在大黃魚終末體重(Final body weight)無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 不同飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例對大黃魚終末體重的影響Fig. 2 Effects of different ratios of dietary palmitic acid to EPA+DHA on the final body weight of large yellow croaker

2.2 肌肉脂肪酸組成

從表3可以看出，隨著飼料中棕櫚酸含量的增加，大黃魚肌肉SFA水平顯著提高(P＜0.05)。P100組大黃魚肌肉的C16∶0含量顯著高于P0組，P100與P50組、P0與P50組之間無顯著差異(P＞0.05)。與P50組相比，P0和P100組大黃魚肌肉的C12:0水平顯著提高(P＜0.05)，P0和P100組相比差異不顯著(P＞0.05)。與P0組相比，P50和P100組大黃魚肌肉的C14:0和C18:0水平顯著提高(P＜0.05)，P50和P100組相比差異不顯著(P＞0.05)。大黃魚肌肉的 C20:0含量在各處理組間相比無顯著差異(P＞0.05)。

表3 不同飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例對大黃魚肌肉脂肪酸組成的影響(mg/g濕重，平均值±標準誤，n=9)1Tab. 3 Effects of different ratios of dietary palmitic acid to EPA+DHA on fatty acid compositions in muscle of large yellow croaker (mg/g, wet basis, Mean±SE, n=9)1

隨著飼料棕櫚酸含量的增加，大黃魚肌肉的單不飽和脂肪酸(MUFA)水平顯著提高(P＜0.05)。P100組大黃魚肌肉的C16:1含量顯著高于P0組，P100與P50組、P0與 P50組相比無顯著差異(P＞0.05)。P100組的大黃魚肌肉C18:1n-9水平顯著提高，P0組含量最低(P＜0.05)。與P50組相比，P0和P100組大黃魚肌肉的C20:1水平顯著提高(P＜0.05)，P0組和P100組相比差異不顯著(P＞0.05)。大黃魚肌肉的C18:1n-7含量在各處理組間相比無顯著差異(P＞0.05)。

隨著飼料棕櫚酸含量的增加，大黃魚肌肉的n-3 PUFA水平顯著降低(P＜0.05)，而肌肉的n-6 PUFA水平各處理組相比無顯著差異(P＞0.05)。P100組的大黃魚肌肉的棕櫚酸/(EPA+ DHA)水平顯著提高，其次是P50組，P0組含量最低(P＜0.05)。P0組大黃魚肌肉的C20:5n-3、C22:6n-3和EPA+DHA水平顯著提高，其次是P50組，P100組含量最低(P＜0.05)。與P50組相比，P0和P100組大黃魚肌肉的C18:3n-3水平顯著提高(P＜0.05)，P0和P100組相比差異不顯著(P＞0.05)。P50組大黃魚肌肉的C20:4n-6含量顯著高于P100組，P50與P0組、P100與P0組相比無顯著差異(P＞0.05)。大黃魚肌肉的 C18:2n-6、DHA/EPA含量在各處理組間相比無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 肌肉質地、pH和持水力

從表4可以看出，P0和P50組大黃魚肌肉硬度、粘附性、內聚性、咀嚼性顯著高于 P100組(P＜0.05)，而 P0和P50組相比無顯著差異(P＞0.05)。P0、P50和P100組在大黃魚肌肉pH和持水力相比無顯著差異(P＞0.05)。

表4 不同飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例對大黃魚肌肉質構特性的影響(平均值±標準誤, n=9)Tab. 4 Effects of different ratios of dietary palmitic acid to EPA+DHA on the flesh texture of large yellow croaker (Mean±SE, n=9)

2.4 肌肉抗氧化能力

大黃魚肌肉抗氧化相關基因表達水平的影響見圖3。從圖3可以看出，P0組大黃魚肌肉的SOD2基因表達水平顯著低于P50和P100組(P＜0.05)，P50和P100組相比無顯著差異。隨著飼料棕櫚酸替代水平的增加，大黃魚肌肉的CAT基因表達水平顯著提高(P＜0.05)。P0組大黃魚肌肉的 Nrf2基因表達水平顯著高于P50組(P＜0.05)，P0和P100組、P50和P100組之間相比無顯著差異(P＞0.05)。大黃魚肌肉SOD1基因表達水平在各處理組間相比無顯著差異(P＞0.05)。

圖3 不同飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例對大黃魚肌肉抗氧化相關基因表達水平的影響(平均值±標準誤, n=3)Fig. 3 Effects of different ratios of dietary palmitic acid to EPA+DHA on the expression level of anti-oxidation-related gene in muscle of large yellow croaker (Mean±SE, n=3)

大黃魚肌肉抗氧化酶活性及T-AOC和MDA含量結果見圖4。從圖4可以看出，P50組大黃魚肌肉T-AOC含量顯著降低(P＜0.05)，P0和P100組含量相比無顯著差異(P＞0.05)。大黃魚肌肉SOD和CAT的活性及MDA含量在3個處理組相比均無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例對大黃魚肌肉抗氧化酶活(a)及MDA(b)和T-AOC(c)含量的影響(平均值±標準誤, n=3)Fig. 4 Effects of different ratios of dietary palmitic acid to EPA+DHA on the activities of anti-oxidative enzymes (a),MDA content (b) and T-AOC (c) in muscle of large yellow croaker (Mean±SE, n=3)

3 討論

3.1 飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)對大黃魚肌肉脂肪酸組成的影響

一方面，相比于P0組，P100組大黃魚肌肉SFA含量顯著增加，MUFA和n-3 PUFA含量顯著降低。這與魚類肌肉脂肪酸組成與飼料脂肪酸存在高度相關性有關(Bahurmiz et al, 2007)；另一方面，P100組的EPA+DHA含量顯著降低，而C18脂肪酸(C18:0和C18:ln-9)含量增加。這和斜帶石斑魚(Epinephelus coioides) (何凌云, 2019)及大西洋鮭(Bell et al, 2002)的研究結果相一致，也表明海水魚類利用脂肪酸的去飽和反應及碳鏈延長反應合成PUFA的能力有限(Cai et al, 1989)。同時，大黃魚生長性能無顯著差異可能與飼料魚粉提供的必需脂肪酸可以滿足大黃魚的基礎生長需要有關。

隨著飼料中棕櫚酸/(EPA+DHA)比例的增加，大黃魚肌肉脂肪酸組成發生改變，可能是肌肉脂肪酸組成反映飼料脂肪酸組成并呈現正相關(Olsen et al,2000)；大黃魚利用脂肪酸去飽和反應和碳鏈延長反應合成PUFA的能力不足(李桑等, 2015)。飼料中均衡的n-3/n-6 PUFA比例對于海水魚類非常重要(鄭建明等, 2019)，在減少飼料氧化基礎上需要提供足夠的EPA+DHA 來滿足魚類必需脂肪酸的需求(柳學周等,2017)。

3.2 飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)對大黃魚肌肉品質的影響

本研究中，P0和P50組大黃魚的肌肉硬度、內聚性、粘附性和咀嚼性顯著高于P100組。飼料中不添加或添加少量棕櫚酸保證魚肉較高的n-3 PUFA含量，而n-6 PUFA含量在各處理組相比無顯著差異。肌肉中較高含量的PUFA顯著增加香味并提升肌肉的多汁性，改善魚的肌肉品質(Menoyo et al, 2004; 邴旭文等, 2005)。Duan 等(2014)研究表明，飼料中魚粉含量為70%時，棕櫚油完全替代魚油并提升大黃魚肌肉的持水力和整體風味，進而改善魚肉品質。而本研究中，飼料棕櫚酸的添加對大黃魚魚肉持水力無顯著變化，可能與大黃魚規格及魚體自身的調控有關。

本研究中，飼料棕櫚酸完全替代EPA和DHA，降低了大黃魚肌肉質構，對肌肉持水力和pH則無顯著影響。持水力是衡量肌肉品質的重要指標(張玉偉等, 2012)，肌肉質構與肌肉持水力有關(Periago et al,2005)。本研究中，3個處理組肌肉持水力相比雖無顯著差異，但飼料中添加棕櫚酸降低了大黃魚肌肉的持水力。毛軻(2014)研究表明，棕櫚酸會促使肌細胞凋亡，破壞成肌細胞肌管形態。因此，飼料棕櫚酸替代EPA和DHA通過降低持水力影響肌肉質構，加上棕櫚酸可能對大黃魚肌細胞產生負面作用來共同導致肌肉品質的下降。

3.3 飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)對大黃魚肌肉抗氧化能力的影響

飼料中棕櫚酸/(EPA+DHA)比例不同造成飼料脂肪酸組成和含量的變化，其對魚的抗氧化能力產生一定影響(Mu et al, 2018)。本研究中，P0組大黃魚肌肉的SOD1與CAT表達水平顯著低于P50和P100組。這與飼料中植物油替代魚油降低魚體的抗氧化基因表達水平不一致(Yu et al, 2016)。P50和 P100組大黃魚肌肉抗氧化基因表達水平較高，可能與棕櫚酸在魚體代謝中刺激細胞產生活性ROS誘導Nrf2的表達，促進抗氧化酶基因轉錄有關(Joshi-Barve et al, 2007)。同時，飼料中適宜的棕櫚酸可以提高飼料的抗氧化性能，從而被魚類有效地吸收利用(韓雨哲等, 2010)。Nrf2受到機體中ROS氧化應激因子刺激后，啟動下游相應抗氧化相關基因(SOD、CAT等)的轉錄，影響機體抗氧化能力(Xu et al, 2015; 胡流芳等，2016)。而P50組大黃魚肌肉的Nrf2基因表達量顯著低于P0組，P100組與 P0、P50組相比無顯著差異，這可能與組內數據差異較大有關，需進一步探究。

Nrf2相關信號轉導對抗氧化酶活性有關鍵調控作用(Gan et al, 2014)。本研究各處理組之間，大黃魚肌肉Nrf2表達水平與T-AOC的變化趨勢相一致。本研究中，P0組飼料EPA+DHA提升肌肉總抗氧化力，飼料中適宜 EPA+DHA可以促進機體產生氧自由基進而增加酶活性保護機體(吉紅等, 2011)；而 P50組大黃魚肌肉 T-AOC顯著降低，說明機體抗氧化能力有所下降。本研究中，P50組大黃魚肌肉MDA含量低于P0和 P100組，可能是因為魚肉 n-3/n-6 PUFA比例不平衡使魚肉脂質沉淀，從而導致MDA含量增加(Yu et al, 2016)。

3.4 飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)投喂下，大黃魚肌肉品質與抗氧化能力的關系

Wu等(2015)研究表明，ROS引起機體脂質和蛋白質的氧化損傷是造成魚肉品質下降的主要原因，而魚類通過提高抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質含量來抵御 ROS，防止氧化損傷(Tang et al, 2013)。棕櫚酸可以引起細胞脂毒性促進 ROS產生，機體抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質含量受到影響，從而降低魚的肌肉品質(Gan et al, 2014; 郝麗紅等, 2016)。因此，抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質含量，即魚的抗氧化能力對魚肉質量比較重要。

本研究中，飼料棕櫚酸完全替代EPA+DHA，導致大黃魚肌肉硬度、內聚性、粘附性和咀嚼性顯著下降，對彈性、pH和持水力無顯著影響。而從肌肉的T-AOC和MDA含量以及SOD和CAT活性等反應抗氧化和氧化狀態的指標來看，純EPA+DHA組(P0)與純棕櫚酸組(P100)相比無顯著差異。由此可見，本研究中，大黃魚肌肉的質構特性與體內氧化-抗氧化狀態的相關性并不強，就其原因與本研究的棕櫚酸或者EPA+DHA的梯度設計數量不夠多，有些趨勢性現象未表現出有關。因此，關于飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例所引起的大黃魚肌肉質構特性的變化與抗氧化之間的關系，還需要做進一步的研究。

4 結論

大黃魚肌肉脂肪酸組成的變化反映了飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例的變化。較高含量的飼料棕櫚酸顯著降低了大黃魚肌肉的硬度、內聚性、粘附性和咀嚼性。飼料棕櫚酸/(EPA+DHA)比例顯著影響大黃魚肌肉的總抗氧化力。但大黃魚肌肉質構特性的變化與肌肉抗氧化能力的變化未表現出較高相關性，這二者之間的關系還需要進一步研究。