長鏈非編碼RNAs靶向軟骨炎癥信號通路調節骨關節炎的研究進展

薛若雪，湯蘇安，阮光峰，丁長海，朱兆華

(南方醫科大學珠江醫院臨床研究中心，廣東 廣州 510000)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)以軟骨厚度丟失、骨質增生和關節周圍組織退變為特征性病理改變。OA長期被認為是一種非炎癥性、退行性疾病，但近年來越來越多的研究認為慢性炎癥是導致OA的重要原因[1]。據報道，OA患者關節液中有大量活化的巨噬細胞[2]、T細胞和B細胞，抑炎因子水平也高于非OA人群[3]。臨床前研究發現，炎癥通路的抑制劑可以延緩OA的發展[4]，觀察性臨床研究表明，系統性低度炎癥與OA疾病發生和進展密切相關[5]，這些證據都顯示炎癥參與了OA的發生及發展。OA軟骨中調控炎癥的主要信號通路有NF-κB、JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT/mTOR等，新近研究發現長鏈非編碼RNAs (long noncoding RNAs，LncRNAs)可以通過調節軟骨炎癥信號通路參與OA的疾病進程[6]。

研究表明僅有2%的人類基因負責編碼蛋白，近年來研究發現這些剩余非編碼基因可以轉錄大量的非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)，而這些ncRNAs具有調節基因表達的重要作用。長度大于200個核苷酸的ncRNAs被稱為LncRNAs，根據相對于蛋白編碼基因的位置不同，LncRNAs又可以分為反義LncRNAs、偽基因LncRNAs、增強子LncRNAs、內含子LncRNAs和長基因間非編碼RNAs[7]。LncRNAs的主要作用有抑制mRNA表達，影響其翻譯、剪切及穩定性；作為非編碼小RNA(microRNA，miRNA，長度約為20-25 nt)的分子海綿，影響miRNA穩定性；表觀修飾DNA，影響基因的轉錄和表達；作為蛋白相互作用的橋梁、調控蛋白活性等[7]。

由于LncRNAs保守性差，不同物種間差異較大，因此本綜述主要匯總了人類OA軟骨組織和細胞中關于LncRNAs參與調控炎癥信號通路的研究，作者以“骨關節炎”、“信號通路”、“軟骨細胞”、“炎癥”、“osteoarthritis”、“chondrocyte”、“inflammatory signaling pathway”、“MAPK”、“PI3K/Akt”、“IL-6/STAT3”、“NF-κB”、“JAK/STAT、“Notch”等為關鍵詞，在Pubmed、NCBI、ResearchGate、Springer、知網、萬方、維普等數據庫中進行檢索，篩選與LncRNAs通過炎癥信號通路調節OA相關的文獻。

納入標準：①OA發生發展相關的文獻；②軟骨細胞相關的文獻；③OA炎癥信號通路相關的文獻；④LncRNAs調控OA發生發展的文獻；⑤發表時間在2014年1月至2021年4月的文獻。排除標準：①獲取不到全文；②非中、英文的文獻；③證據等級及質量相對較低的文獻；④作用機制非炎癥信號通路的文獻；⑤LncRNAs來源非人類的文獻。共檢索得到449篇文獻，摘要及全文閱讀后排除413篇文獻，重點閱讀剩余的29篇文獻，并列出LncRNAs通過炎癥通路調節OA進展的詳情表(Tab 1)，分別介紹如下。

1 NF-κB信號通路

核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)屬于Rel家族的轉錄因子，幾乎存在于所有多細胞有機體中。NF-κB信號通路可通過增加炎癥因子interleukin (IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-17及tumor necrosis factor (TNF)-α的表達、調控基質金屬蛋白酶生成，促進軟骨細胞炎癥和凋亡反應進而導致OA的發生和進展[7]。

當前研究已經發現有3個LncRNAs可能參與了NF-κB信號通路相關的OA。一是LncRNA GAS5，其過表達可以通過上調KLF2表達抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的ATDC5軟骨細胞炎癥損傷和凋亡[8]。KLF2是參與NF-κB和Notch信號通路的關鍵酶，也是LncRNA GAS5的作用靶點[9-10]。另一個通過NF-κB調節OA的LncRNA是RP11-445H22，研究發現LncRNA RP11-445H22的敲除可以緩解LPS誘導的關節軟骨細胞損傷，提高細胞活力、抑制炎癥和凋亡因子表達[11]。RP11-445H22與miR-301a結合，而CXCR4是miR-301a的作用靶點，CXCR4的沉默會阻斷LPS誘導的NF-κB和MAPK/ERK信號通路[11]。此外，有學者觀察到在LPS損傷的軟骨細胞中LncRNA ATB表達下調[12]，而過表達LncRNA ATB可明顯減輕LPS誘導的ATDC5細胞炎性損傷。進一步實驗表明，LncRNA ATB通過下調LPS損傷細胞中的miR-223來抑制髓樣分化因子/NF-κB通路，從而保護ATDC5細胞免受LPS誘導的炎癥性損傷。

Tab 1 LncRNAs regulate OA through inflammatory pathways

抑制NF-κB信號轉導將會對OA及相關的慢性炎癥性疾病起治療作用。但是NF-κB廣泛調節機體的免疫反應和細胞凋亡，具有多個作用靶點，這要求NF-κB抑制劑必須更加精準。因此，研究LncRNAs靶向調控NF-κB在OA發病機制中的作用，可為OA的靶向治療提供新策略。

2 IL-6/STAT3或JAK/STAT通路

白介素6/信號轉導與轉錄激活子(interleukin-6/signal transducer and activator of transcriptions，IL-6/STAT3)或Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT)通路與炎癥和免疫有重要關系，IL-6刺激JAK受體發生磷酸化，磷酸化JAK又是STAT分子的識別和結合位點，STAT分子因此被誘導進行磷酸化，磷酸化STAT分子以二聚體形式進入胞核，調節特定基因的表達[11]。近期研究報道有四個LncRNAs與STAT通路介導的OA軟骨損傷有關。IL-6刺激后ATDC5 細胞活力降低，并通過下調microRNA-146a的表達進而上調Lnc CHRF的表達[13]，Lnc CHRF敲減后效果則相反。IL-6誘導IκBα、p65、JAK1和STAT3在磷酸化水平的積累進一步被Lnc CHRF促進。總之，Lnc CHRF通過STAT3信號通路加重了ATDC5細胞中IL-6誘導的炎癥損傷。有研究者指出，LncRNA DANCR可作為miR-216a-5p的競爭性內源RNA來調控OA軟骨細胞的凋亡[14]，而JAK2是miR-216a-5p的直接靶點，DANCR通過miR-216a-5p調控OA軟骨細胞中的JAK2/STAT3信號通路，從而促進OA軟骨細胞的增殖、減少細胞凋亡。此外，有研究發現LncRNA GACAT3在OA組表達顯著高于照組，且這種上調可能與IL-6/STAT3炎癥通路的激活有關[15]。最近一項關于LncRNA THRIL的研究發現THRIL在LPS誘導的軟骨細胞炎癥損傷中上調，且在miR-125b的參與下，THRIL可進一步活化軟骨細胞中LPS誘導的JAK1/STAT3和NF-κB信號通路[16-18]。

3 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在細胞的生長、分化以及炎癥反應等多種病理生理過程中發揮重要作用，是真核生物信號傳遞網絡的關鍵途徑之一，近年來在OA的研究中也越來越多。研究認為LncRNA RP11-445H22通過結合miR-310a進而沉默趨化受體因子(chemokine receptor，CXCR4)，CXCR4沉默可阻斷LPS激活的MAPK/ERK通路，從而抑制ATDC5細胞的凋亡和炎癥細胞因子分泌，顯著逆轉LPS誘導的軟骨損傷[9]。LncRNA XIST也可以通過調節MAPK信號通路顯著抑制IL-1β誘導的OA軟骨細胞凋亡[19]。LncRNA XIST還可作為miR-211的內源性競爭RNA，對抗miR-211介導的CXCR4抑制，進一步抑制下游MAPK信號通路從而調控軟骨細胞增殖和凋亡[19]。最近一項研究發現在OA軟骨中，LncRNA HOTAIRM1-1在誘導間充質干細胞成軟骨分化后4 d表達明顯增加，8 d后進一步增強，而miR-125b表達則相反。進一步研究發現，LncRNA HOTAIRM1-1通過ceRNA機制直接抑制miR-125b的功能，進而上調潛在靶點BMPR2的表達，而BMPR2過表達抑制JNK/MAPK/ERK通路的激活，提示該通路可能是介導LncRNA HOTAIRM1-1在OA發展的下游機制[20]。

4 其他炎癥調節相關通路

4.1 花生四烯酸通路炎癥反應通過炎癥介質誘導，而炎癥介質主要由花生四烯酸通路產生，因此靶向抑制花生四烯酸通路的藥物成為治療關節炎癥和疼痛的重要研究方向。事實上，臨床試驗證明環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑(如非甾體類抗炎藥布洛芬等)可以減輕關節炎癥狀[19]。Krawczyk等[21]在2014年發現LncRNA PACER可能是調節COX-2的潛在靶點。隨后Qian等[22]發現LncRNA PACER能夠不通過NF-κB p50通路激活COX-2，而LncRNA PACER敲除后COX-2的過表達得到抑制，細胞增生和炎癥得到緩解。2019年，Jiang等[23]研究發現在OA患者血漿中LncRNA PACER表達下調，并提示LncRNA PACER是Lnc HOTAIR的上游抑制劑，后者的過表達會導致軟骨細胞凋亡。

4.2 Notch信號通路Notch信號通路在細胞生長、形態維持和凋亡等方面發揮重要作用，在進化中高度保守。有關LncRNAs通過Notch信號通路調節OA的研究極少。Saito等[25]發現LncRNA TUG1的表達在大黃素處理后上調，而Notch和NF-κB通路則被大黃素抑制。進一步的實驗證明了大黃素通過上調LncRNA TUG1表達使Notch和NF-κB這兩條通路失活。但是還沒有實驗證實LncRNA TUG1的敲除會延緩OA進展，也沒有報道通過抑制LncRNA TUG1來預防和治療OA。

4.3 PI3K/AKT/mTOR 信號通路有研究在缺氧條件下培養ATDC5軟骨細胞，建立OA細胞模型，并測定OA與正常軟骨組織中低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和LncRNA HIFCAR的表達。結果表明OA中LncRNA HIFCAR和HIF-1α表達均上調，抑制LncRNA HIFCAR可促進細胞增殖、抑制凋亡、減少TNF-α和IL-6的分泌、抑制基質金屬蛋白酶的合成從而顯著改善缺氧誘導的細胞損傷[26]。此外，LncRNA HIFCAR能顯著抑制缺氧誘導PI3K/AKT/mTOR途徑的激活，提示PI3K/AKT/mTOR通路是LncRNA HIFCAR介導OA發展的一種可能機制。

5 在OA治療中潛在應用價值

以LncRNAs為靶點治療OA的實驗已經在動物層面開展。Wang等[27]在2021年發表的文章中通過體內實驗證實，敲低LncRNA SNHG14 可通過靶向miR-124-3p抑制FSTL-1介導的NLRP3激活和 TLR4/NF-κB信號通路激活，從而抑制炎癥反應，緩解大鼠OA的進展。該文章通過動物實驗證實了LncRNA SNHG14具有減輕OA炎癥的治療效果。Liu等[28]發現LncXIST在OA軟骨組織和 IL-1β 處理的軟骨細胞中以高水平表達，敲低Lnc XIST促進了細胞活力，抑制了IL-1β處理的軟骨細胞中的細胞凋亡和細胞外基質 (ECM) 蛋白降解。進一步通過大鼠OA模型研究表明靶向抑制LncRNA XIST在體內具有OA治療作用，其作用機制通過調節體內miR-149-5p/DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A)軸的表達實現。Wang等[29]發現Lnc PVT1與關節軟骨降解密切相關，而在實驗動物關節內注射Lnc PVT1抑制劑可有效地減輕關節炎癥，降低促炎介質的表達，并抑制了 TGF-β/母抗Dpp小同源物4(small mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4)通路。提示通過抑制Lnc PVT1的表達，進而抑制 TGF-β/SMAD4通路，能夠減輕關節炎癥反應，在OA中具有潛在治療效果。Han等[7]在最新發表的文章中研究了LncRNA MEG3對膝骨關節炎大鼠滑膜細胞增殖和凋亡的影響，研究發現LncRNA MEG3可提高第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)水平，減弱大鼠滑膜細胞的增殖能力，提高其凋亡水平，加重關節炎癥反應，揭示了LncRNA MEG3能夠通過改變大鼠PTEN表達水平進而調控滑膜細胞增殖和凋亡，從而影響OA疾病進程。因此，動物實驗初步表明通過上調或下調特定的LncRNAs表達可以抑制相關炎癥通路的表達，進而對OA起到治療作用[29]。

6 討論與展望

慢性低度炎癥是OA發生發展的重要病因，OA的炎癥亞型也受到越來越廣泛的關注。LncRNAs在OA炎癥機制中的研究是一個新的領域，其中起關鍵調控作用的LncRNAs有望成為OA治療的新靶點[2]。目前已陸續有研究鑒定出一些在病變的關節組織中差異表達的LncRNAs，這些LncRNAs作為炎癥通路的關鍵調控因子在OA中的功能已在體內外實驗中得到確證[3]。雖然LncRNAs是OA潛在的診斷標志物和治療靶點，但在應用到臨床前，還有諸多挑戰需要面對。首先，雖然有大量的LncRNAs在OA中具有差異性表達[4]，但目前只有很小部分LncRNAs的作用機制被闡明，而OA的多種臨床癥狀很可能需要結合多種LncRNAs及其靶點來解釋[15]。因此要闡明LncRNAs調節OA的作用機制，更為先進和高效的檢測以及分析手段是必不可少的。其次，關于LncRNAs在OA軟骨細胞中作用的研究大部分是在體外實驗，還需要更多藥理學可信服的驗證數據。此外，如何平衡LncRNAs的高效性和低毒性，將需要更為先進的給藥物遞送系統[26]。 總之，深入研究OA炎癥機制相關的LncRNAs將進一步為OA的預防和治療提供新思路和新策略。