DNA末端保護盾Shieldin在DNA損傷修復中的研究進展

周珂輝，劉延慶，陶 麗

(揚州大學醫學院，國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009)

DNA損傷修復是保障基因組穩定性，并將遺傳信息準確無誤地傳給子代細胞的關鍵。損傷一旦發生后，細胞啟動一系列損傷監控和修復機制，即所謂的DNA損傷應答(DNA damage response，DDR)。作為最為嚴重的DNA損傷形式——DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)，細胞采取兩種修復途徑，即同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。決定這兩條途徑選擇性進行的關鍵步驟是末端切除及切除的核苷酸長度。HR途徑中，DSBs一條鏈末端5′→3′方向首先被切除掉上千個堿基，另一條鏈則形成較長的3′突出單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾，這一過程被稱為末端切除(end resection)[1]。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)與其它核心蛋白(BARD等)形成復合體促進末端切除，BRCA2負責與重組酶RAD51結合并將其招募至3′單鏈DNA末端，形成RAD51單鏈DNA纖維(RAD51 filament)，侵入姐妹染色單體中的同源序列完成修復過程；NHEJ則是將斷裂的DNA末端直接相連，利用損傷區域微同源序列形成粘性末端，通過堿基互補配對，無需切除或只需切除末端小片段非同源ssDNA，再將斷裂的DNA重新連接。NHEJ包括3條途徑，異二聚體Ku依賴的經典途徑(canonical NHEJ，c-NHEJ)，Ku非依賴的替代性途徑(alternative NHEJ，a-NHEJ)與及單鏈退火途徑(single-strand annealing，SSA)。這3種NHEJ途徑的主要區別在于微同源序列的長度不同。c-NHEJ只需0-5 bp的同源序列，a-NHEJ需5-25 bp的同源序列，而SSA則需要>30 bp的同源序列[2]。因此，限制或保護DNA斷端不被大范圍切除，即可將HR修復途徑轉向NHEJ途徑。DNA斷端保護介導的DSBs修復途徑轉換機制一直是DNA損傷修復研究的國際前沿問題[3]。

1 Shieldin的發現

作為HR與NHEJ修復途徑選擇的決定因子，p53結合蛋白(p53 binding protein 1，53BP1)，通過招募另一染色質支架蛋白RIF1(Rap1 interacting factor)競爭性抑制BRCA1依賴的末端切除，將DSBs修復引導至NHEJ途徑[4]。但是53BP1-RIF1通路抑制末端切除機制的下游效應因子仍不清楚。2015年，DNA聚合酶ζ的小亞基REV7(又稱為MAD2L2或MAD2B)被鑒定為53BP1-RIF1限制末端切除的一個下游因子[5-6]。2018年，丹麥哥本哈根大學研究團隊在利用親和純化與質譜偶聯的鄰近標記技術繪制了53BP1參與DNA損傷修復的蛋白互作網絡，發現了與REV7直接互作的CTC-534A2.2，并揭示其促進NHEJ的生物功能，命名為RINN1，同時發現另外兩種協作蛋白FAM35A與C20orf196，分別命名為RINN2與RINN3。作者首次將REV7、RINN1、RINN2與RINN3組成的復合物命名為Shieldin。顧名思義，Shieldin具有DNA末端防衛、保護的寓意，取自于端粒保護復合體Shelterin[7]。

根據協同致死作用，BRCA1/2突變的HR缺陷腫瘤對PARP(poly (ADP-ribose) polymerase)抑制劑格外敏感[8]，而去除53BP1使腫瘤恢復了HR修復能力而產生PARP抑制劑抵抗。加拿大多倫多大學研究團隊基于這一實驗表型，利用CRISPR/Cas9技術篩選53BP1遺傳互作分子，也發現了FAM35A、C20orf196與CTC-534A2.2在促進NHEJ并抑制HR功能中的作用，并將C20orf196重新命名為SHLD1(RINN3)，FAM35A重新命名為SHLD2(RINN2)，CTC-534A2.2重新命名為SHLD3(RINN1)[9]。與此同時，國際上其它多個課題組也相繼證實了Shieldin復合體是53BP1-RIF1下游效應因子，引發了Shieldin研究熱潮[10-14]。

2 Shieldin的分子結構與組裝機制

Shieldin復合物4個亞基中的REV7是編碼211個氨基酸，分子量大小為24 ku的適配蛋白，中間含有1個HORMA結構域，C端含有1個被稱之為“安全帶”的結合模序(Seatbelt-binding motif，SBM)，是連接SHLD2和SHLD3的橋梁分子。SHLD1C20orf196位于20號染色體，編碼205個氨基酸，分子量為23 ku，位于復合體信號鏈末端；SHLD2FAM35A位于10號染色體，編碼835個氨基酸，分子量為92 ku，其C端含有3個寡核苷酸/寡糖結合折疊(OB-fold)結構域(OBA/OBB/OBC)，使Shieldin復合物定位并組裝在斷裂DNA末端單鏈DNA上，C端OBC上的兩個CXXC模序與SHLD1綁定，N端與REV7綁定。SHLD3CTC-534A2.2位于5號染色體，編碼250個氨基酸，分子量為29 ku，其N端含有兩個預測的REV7結合模序(PxxxpP，REV7-binding motif，RBM)，C端含有翻譯延長因子EIF4E樣結構域。同其它含有RBM模序的REV7結合蛋白相同，SHLD3通過自身的RBM與REV7上的SBM綁定在一起，位于復合體信號鏈最上游(Fig 1A)。綜上，Shieldin復合物自上而下的工作順序為SHLD3-REV7-SHLD2-SHLD1[15]。

2020年，中國科學院生物物理研究所周政課題組首次解析了SHLD3結合REV7的高級結構SHLD3-RBD(REV7-binding domain)。SHLD3-RBD形似長柄勺，通過N端loop勺柄及其C端α-螺旋勺體與REV7的SBM拴在一起[16]。同年，北京大學尹玉新課題組成功制備并解析了含SHLD3-REV7-SHLD2三元復合物的高分辨率晶體結構，發現SHLD3-SHLD2結合2個REV7分子，分別呈現關閉(Closed)C-REV7和開放(Open)O-REV7的兩種構象，即C-REV7-O-REV7構象二聚體(conformational dimer)，重新定義了SHLD3-REV7-SHLD2復合物實為四聚體結構，且REV7構象二聚體為NHEJ效率所必需[17]。Clairmont等[18]也通過冷凍電鏡技術證實了REV7構象二聚體的存在，發現C-REV7為結合態/激活態而O-REV7為松弛態/失活態，進一步明確C-REV7與SHLD3通過SBM綁定在一起(Fig 1B)。REV7二聚化依賴HORMA結構域[19]，Sarangi等[20]發現C-REV7向O-REV7轉變不僅依賴TRIP13(下文介紹)，還依賴于p31comet適配蛋白，該蛋白自身也包含一個HORMA結構域，具體的機制還有待解析。

Fig 1 Subunits and model of Shieldin complex

3 Shieldin抑制HR修復的分子機制

Shieldin抑制HR修復存在兩種機制，一是限制HR上游末端切除的進行(末端切除前)，其二是限制HR下游BRCA2/RAD51的加載(末端切除后)。一方面，Shieldin通過招募一種單鏈DNA保護蛋白——端粒結合蛋白復合物CST(Ctc1、Stn1、Ten1)作為聚合酶α/引物酶輔助因子(polymeraseα/primase accessory factor)，通過合成新的ssDNA填充斷裂DNA末端缺口，從而防止末端切除的發生。互作分析發現，SHLD1與CST復合物中的Ctc1強烈結合，提示SHLD1是Shieldin招募CST的主導者[11]。另一方面，Shieldin抑制HR修復還存在末端切除后機制。BRCA1缺陷細胞替代性利用E3泛素連接酶RNF168招募乳腺癌易感基因相關蛋白PALB2與BRCA2而啟動RAD51纖維形成。Shieldin復合物中的SHLD3可以抑制該通路，減少RAD51纖維而阻斷HR修復途徑，使得BRCA1/53BP1雙突變細胞中發生末端切除正常而無RAD51加載的現象[13]。此外，在BRCA1/53BP1雙敲除細胞中，SHLD2完整的OB折疊結構域與ssDNA的結合作為BRCA2/RAD51物理屏障對抑制HR途徑十分關鍵[18]。末端切除后機制的發現也從側面證實了HR途徑中RAD51加載可以與末端切除解耦聯。

4 Shieldin信號的滅活機制

為進一步理解Shieldin介導的末端保護與促進NHEJ修復途徑的負向調控機制，Clairmont等從REV7結合蛋白組中又鑒定了新的靶蛋白TRIP13(thyroid hormone receptor interacting protein 13)。TRIP13是甲狀腺激素受體相互作用蛋白，屬于AAA-ATPase家族。研究顯示TRIP13通過負向調控紡錘體組裝檢查點和DNA修復促進染色體不穩定性，從而促進腫瘤的發生與發展。與敲除REV7產生RARP抑制劑抵抗效應相反，敲除TRIP13可以增強PARP抑制劑敏感性，因此推測TRIP13可以負向調控REV7。根據TRIP13催化其已知底物紡錘體組裝檢查點蛋白MAD2從關閉構象(C-MAD2)轉為開放構象(O-MAD2)，研究同樣證實了REV7構象二聚體現象，且其中的C-REV7通過SBM與SHLD3結合，TRIP13可以使C-REV7-SHLD3解聚從而拮抗REV7功能，促進末端切除與HR修復，使BRCA1缺失腫瘤對PARP抑制劑的敏感性降低[21-22]。最近，Xie等[22]解析了TRIP13去組裝Shieldin的結構機制，發現TRIP13利用其六聚分子馬達介導的孔道旋轉動力促進C-REV7的N端未折疊肽段拉入至TRIP13中心孔道，實現C-REV7從Shieldin復合物中分離。

5 Shieldin與腫瘤的關系及其臨床價值

一方面，去除Shieldin復合物的任何一個亞基均使BRCA1缺陷的腫瘤產生PARP抑制劑抵抗，Shieldin功能喪失可以挽救BRCA1缺陷腫瘤HR活性，誘導PARP抑制劑耐藥的發生。在BRCA1缺失的臨床腫瘤樣本的PDX(patient-derived xenografts)模型小鼠中，SHLD1/2的表達水平與PARP抑制劑的敏感性成正相關性[18]。因此，針對革命性抗腫瘤藥物PARP抑制劑耐藥的臨床困境，Shieldin復合物及其分子互作可以為解析PARP抑制劑耐藥機制提供新的視角。另一方面，與易錯修復的NHEJ相比，HR是一種精準無誤的修復途徑，Shieldin是負向調控HR且正向調控NHEJ的終末效應因子，因此Shieldin信號過度活躍可以誘導突變的積累與基因組不穩定性，從而促進腫瘤的發生發展。在荷瘤小鼠模型中，敲除Shieldin中的SHLD1或SHLD2能夠增加BRCA1缺失腫瘤對鉑類化療藥物與電離輻射(IR)的敏感性，提示在BRCA1缺失腫瘤中靶向Shieldin與放化療療效之間存在協同關系[18]。因此，深入探討Shieldin復合物的分子間交互或旁路交互機制對BRCA1突變/缺失腫瘤的分類治療具有轉化醫學意義。

Shieldin結構生物學研究的更新進一步提供了針對該復合物設計可藥靶的結構位點。REV7的安全帶結構是其與多種互作蛋白結合的結構基礎[23]。在SHLD3-REV7互作界面上，除了設計干擾REV7安全帶結構從而促進SHLD3解綁的小分子調節劑外，最新研究提出SHLD3疏水性氨基酸殘基(38-FIPWF-42)覆蓋的REV7-β轉角界面，又稱為site-S，是一個更為理想的藥物靶位。由于site-S還部分存在于REV7-REV1互作界面，而靶向REV7-REV1互作，可以抑制跨損傷DNA合成(translesion DNA synthesis, TLS)帶來的基因組突變與放化療抵抗。因此，設計針對site-S的小分子藥物，實現NHEJ與TLS的雙重抑制而增強放化療敏感性，具有一定的應用前景[22]。

6 結語與展望

Shieldin是近3年DNA損傷修復的新興熱點方向，其研究處于起步上升階段。我們課題組前期研究發現[24]，中藥三萜類活性分子可以誘導DSBs，在抑制53BP1功能的同時上調細胞核內RAD51的加載，提示三萜活性分子可以調控53BP1與RAD51互為拮抗的作用。作為53BP1下游直接阻斷RAD51加載的調控分子，Shieldin的發現對進一步在藥理學上闡明中藥活性分子干預兩種修復途徑轉換機制提供了新的科學依據。鑒于其結構復雜程度，特別是REV7構象二聚體在調控Shieldin復合物活性發揮DSBs修復途徑的選擇性機制仍不明晰。同時，Shieldin對腫瘤生物學與放化療、靶向治療的響應產生重要影響，對病人預后的評估提供新的參考或治療機遇，并在病人腫瘤樣本中證實Shieldin的臨床價值，開發特異性阻斷Shieldin復合物分子內互作(C-REV7-SHLD3)或旁路互作(C-REV7-TRIP13或SHLD1-CST)的小分子調節劑可能為腫瘤的精準治療帶來曙光。此外，除了DSBs修復，Shieldin在抗體類別轉換重組、端粒保護以及停滯復制叉等其它生物學過程發揮重要功能[15]，是今后需要開辟與延續的研究方向。