紅景天苷衍生物對苯甲酰紅景天苷對MCAO大鼠的神經保護作用

聶婧雯，孫春曉，黃私迎，羅 銳，賴文芳，王穎崢，洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦卒中是由于血液循環受阻而引起的疾病，約有75%的患者產生不同水平的殘疾，且極易復發。缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，約占87%[1]。組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)是臨床首選治療藥物，其治療時間窗窄(僅4.5 h左右)，且只對3%～5%的腦卒中病人有治療效果[2]。因此，迫切需要研發更安全、更有效的藥物。

紅景天苷(salidroside，sal)見Fig 1，是中藥紅景天的主要有效成分及藥效物質基礎的標志物。課題組前期研究證明，紅景天苷具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡的作用[3-5]。由于紅景天苷是多羥基化合物，極性大，水溶性極好，脂溶性差，作用于中樞神經系統時具有局限性。一方面，紅景天苷難以通過脂質膜，不易被腸胃吸收進入組織，亦難透過血腦屏障；另一方面，其在體內易被代謝，藥效降低，藥理活性減弱。一次給藥后，3 h后在血液和腦組織中幾乎檢測不到紅景天苷，其在血液中的半衰期約40 min[6-7]。

Fig 1 Salidroside

為改善紅景天苷的脂溶性、優化傳輸、提高在體內的穩定性，達到增強藥效的目的，課題組對紅景天苷進行了結構修飾，通過酯化紅景天苷分子中苷元上的酚羥基以及糖基上的醇羥基，接入不同的基團，合成了29個紅景天苷衍生物，并進行體外藥效篩選，優選出具有更好療效的衍生物對苯甲酰紅景天苷(pOBz，見Fig 2)[8]。課題組已就pOBz的結構及其應用申報國家發明專利(申請號：201710756613.1)[9]。pOBz對于在體內是否具有更好的改善腦卒中療效，本研究將進一步探討。

Fig 2 pOBz

1 材料

1.1 實驗動物SPF級健康♂SD大鼠72只，體質量(260±10)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK(滬)2014-0002，合格證號：2015000518015。于福建中醫藥大學實驗動物中心進行飼養，使用合格證：SYXK(閩)2014-0005，適應性喂養1周。本動物實驗均遵循動物實驗倫理要求。

1.2 實驗藥物與主要試劑對苯甲酰紅景天苷(福建中醫藥大學藥學院提供，純度≥99%，用含5% Tween-80的生理鹽水配制成10 g·L-1)；紅景天苷(福建中醫藥大學藥學院提供，純度≥99%，用0.9%生理鹽水配制成10 g·L-1)；NeuN抗體(Abcam，貨號：ab177487)；β-actin抗體(Trans Gen Biotech，貨號：110813)；Bax抗體(貨號：#2772)，Bcl-2抗體(貨號：#2762)，均購自CST；EGR1抗體(Santa Cruz Biotech，貨號：sc-110)。

1.3 實驗儀器凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司，型號：ChemiDoc XRS+)；7.0T小動物核磁共振成像儀(德國Broker公司，型號：Biospec70/20 USR)；熒光倒置顯微鏡(Leica公司，型號：DMI8)；石蠟切片機(Thermo公司，型號：HM325)；紫外可見分光光度計(Thermo公司，型號：ND2000C)；多功能酶標儀(TECAN公司，型號：Infinite M200 Pro)；大鼠腦模具(瑞沃德公司，型號：68709)；線栓(廣州佳靈，貨號：L3600)。

2 方法

2.1 分組及給藥

2.1.1不同劑量pOBz對MCAO大鼠的影響 30只健康成年♂SD大鼠，隨機分為Sham組、MCAO組、MCAO+pOBz低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)，每組6只。造模成功后，Sham組和MCAO組大鼠腹腔注射(ip)生理鹽水(10 mL·kg-1)，對MCAO+pOBz給藥組分別ip 25、50、100 mg·kg-1pOBz，每天記錄體質量，連續給藥2 d后取材。

2.1.2pOBz和Sal對MCAO大鼠的影響 24只健康成年♂SD大鼠，隨機分為Sham組、MCAO組、MCAO+pOBz組和MCAO+Sal組，每組6只。Sham組和MCAO組大鼠ip生理鹽水(10 mL·kg-1)，MCAO+pOBz組ip pOBz(50 mg·kg-1)，MCAO+Sal組紅景天苷(50 mg·kg-1)，給藥1 d后取材。

2.1.3pOBz對MCAO大鼠大腦皮層NeuN表達的影響 18只健康成年♂SD大鼠，隨機分為Sham組、MCAO組和MCAO+pOBz組，每組6只。Sham組和MCAO組大鼠ip生理鹽水(10 mL·kg-1)，MCAO+pOBz組ip pOBz(50 mg·kg-1)，連續給藥2 d后灌注固定取腦。

2.2 MCAO模型的制備大鼠禁食(不禁水)12 h后，2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉。分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，在頸總動脈剪一小口，插入線栓,結扎頸內動脈。阻塞2 h后拔線栓，實現再灌注。Sham組除不插入線栓外，其余操作同MCAO組。手術中維持大鼠體溫，術后自由攝食飲水。待大鼠清醒參考Zea-Longa 5級評分制[10]進行神經功能損傷評分，2～3分說明模型成功，可用于后續實驗。

2.3 取材麻醉大鼠后，使用采血針對腹主動脈放血，剪斷大鼠頸部，剪開頭部的皮膚，暴露頭骨并用線剪剪開，使用手術鉗翻開頭骨，使整個腦組織暴露，取出大腦并分離左右腦，迅速放入做好標記的凍存管中，移入液氮保存。

2.4 MRI檢測MCAO大鼠腦梗死體積將大鼠用異氟烷麻醉，俯臥位固定于動物床上，利用大鼠頭部表面線圈檢測，冠狀定位掃描，采用T2W1增強系列。成像參數：T2W1采用TSE序列，TE 33 ms，TR 2700 ms，24層，矩陣30 mm×30 mm，Rfov 60%，NSA 15，掃描5 min 50 s。

2.5 Western blot檢測蛋白表達提取總蛋白，測定蛋白濃度，經電泳分離總蛋白后，轉膜，5%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜，各一抗稀釋倍數分別為NeuN(1 ∶3 000)、EGR1(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)及Bax(1 ∶1 000)。TBST洗3次，10 min/次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，10 min/次。檢測目標條帶并分析條帶的灰度值。

2.6 免疫熒光染色觀察NeuN的表達將固定24 h的腦組織進行切片、脫水、透化、石蠟包埋及制作組織片。之后脫蠟復水、熱抗原修復，5% BSA封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，NeuN抗體稀釋倍數(1 ∶200)。次日復溫40 min，PBS搖洗3次，3 min/次。熒光二抗室溫避光孵育2 h，PBS避光搖洗3次，3 min/次。甩去PBS，DAPI染色8 min，PBS避光搖洗3次，每次3 min。采用抗淬滅劑封片，于熒光倒置顯微鏡觀察組織染色情況。

Fig 3 Effect of pOBz on cerebral infarction volume in rats

3 結果

3.1 不同劑量 pOBz對MCAO大鼠的影響

3.1.1pOBz對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 同MCAO組比較，MCAO+pOBz中劑量組(50 mg·kg-1)和MCAO+pOBz高劑量組(100 mg·kg-1)的腦梗死體積明顯減少(P<0.01)，且50 mg·kg-1pOBz的腦梗死體積改善優于100 mg·kg-1(P<0.05)，見Fig 3，4。

Fig 4 Effects of different doses of pOBz on volume of cerebral infarction in MCAO rats n=6)

3.1.2pOBz對MCAO大鼠神經功能損傷評分的影響 大鼠神經功能損傷評分在2-3分視為造模成功，pOBz給藥后，大鼠神經功能損傷評分呈下降趨勢，50 mg·kg-1pOBz給藥2 d后評分下降(P<0.05)，見Fig 5。

3.1.3pOBz對MCAO大鼠體質量減輕的影響 造模后，大鼠的體質量減輕，同MCAO組比較，MCAO+pOBz中劑量組(50 mg·kg-1)(P<0.01)和MCAO+pOBz高劑量組(100 mg·kg-1)(P<0.05)的體質量減輕小于模型組，見Fig 6。

Fig 5 Effects of different doses of pOBz on neurological function damage score of MCAO rats n=6)

Fig 6 Effects of different doses of pOBz on body weight of MCAO rats n=6)

3.2 pOBz和Sal對MCAO大鼠的影響

3.2.1pOBz及Sal對MCAO大鼠NeuN蛋白表達的影響 與Sham組相比，MCAO組大鼠腦組織的NeuN表達減少(P<0.05)，pOBz給藥組和Sal給藥組NeuN的表達升高，且pOBz給藥組升高的程度明顯高于Sal給藥組(P<0.05或P<0.01)，見Fig 7。

Fig 7 Effects of pOBz and salidroside on NeuN

3.2.2pOBz及Sal對MCAO大鼠的EGR1蛋白表達的影響 與Sham組相比，MCAO大鼠腦組織的EGR1表達減少，pOBz給藥組表達升高，Sal給藥組無明顯變化(P<0.05或P<0.01)，見Fig 8。

Fig 8 Effects of pOBz and salidroside on EGR1

3.2.3pOBz及Sal對MCAO大鼠的Bcl-2/Bax比值的影響 與Sham組相比，MCAO大鼠腦組織的Bcl-2/Bax比值降低，pOBz給藥組和Sal給藥組增加了Bcl-2/Bax的比值，升高的程度相同，見Fig 9。

Fig 9 Effects of pOBz and salidroside on Bcl-2/Bax

3.3 pOBz對MCAO大鼠大腦皮層NeuN表達的影響與Sham組相比，MCAO大鼠腦組織的NeuN表達減少，且形態上發生改變；pOBz給藥組(50 mg·kg-1)NeuN表達增加，形態上也得到很大程度的恢復，見Fig 10。

Fig 10 Effects of pOBz on NeuN immunofluorescence expression in MCAO rats (400×)

4 討論

本研究采用MCAO模型能夠較好地模擬腦缺血疾病。MRI結果確認了pOBz能夠改善48 h的MCAO大鼠腦梗死體積，并確定最佳給藥劑量是50 mg·kg-1。課題組前期TTC結果顯示pOBz給藥2 d能夠顯著改善MCAO大鼠的腦梗死體積，而Sal給藥2 d沒有改善梗死體積，到d 6 Sal才表現出改善梗死面積。劉俊杰[11]、謝秀利[12]等也報道連續給藥6 d后觀察到Sal改善腦梗死體積。

神經功能損傷評分結果顯示pOBz給藥后評分均呈下降趨勢，50 mg·kg-1pOBz給藥組大鼠的神經功能損傷評分得到顯著改善。課題組前期報道Sal給藥d 6可以觀察到神經功能損傷評分的改善[3]，與腦梗死體積結果一致。同時本研究還觀察到，50和100 mg·kg-1pOBz給藥2 d可以顯著改善MCAO大鼠體質量的減少，這在Sal的研究中未見報道。臨床上腦卒中患者發病后機體大量蛋白質損失，加上進食減少，導致營養不良、體質量下降，使得患者預后較差，死亡率提高[13]。神經功能損傷的程度越高，體質量恢復能力就越差，Long等[14]研究表明，促進體質量的恢復可以改善神經功能缺損，二者相輔相成。pOBz給藥2 d可以改善體質量的降低，也反映了對神經缺損的改善，同時體質量的增加促進MCAO大鼠神經功能的改善，有益于疾病預后恢復。

不管是腦梗死還是神經功能損傷，其本質都是由于腦供血中斷導致的神經元損傷和神經功能喪失。目前已經發現Sal在MCAO模型中具有神經保護作用[3,12,15]。神經元核抗原(NeuN)是成熟神經元細胞的標記，MCAO大鼠NeuN減少，是神經元特異質基因的改變[16]。從免疫熒光染色結果中可見pOBz給藥2d對MCAO大鼠NeuN蛋白表達在形態和數量上都有明顯的改善。課題組前期研究顯示，Sal可以升高24h MCAO大鼠NeuN的表達[4]，而本研究顯示pOBz誘導NeuN的升高程度優于Sal。EGR1是早期生長反應蛋白之一，缺血性腦卒中發生后關鍵差異表達的基因，其表達可以預防神經元損傷以及減輕腦卒中后的血栓形成和炎癥[4,17]。課題組前期發現，Sal在缺血后24 h不改善EGR1的表達，而48 h后能夠觀察到EGR1升高[3]，本研究中pOBz在24 h時即可顯著升高MCAO大鼠EGR1的表達。這些結果提示pOBz在蛋白表達水平對腦缺血/再灌注大鼠的神經保護作用優于Sal。

線粒體在細胞凋亡過程中扮演重要角色。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax蛋白同屬Bcl家族，對調節線粒體膜通透性、線粒體功能及Cyt-c釋放起至關重要的作用。缺血性腦卒中發生后，Bax在腦中表達增加，抑制Bax或表達Bcl-2可減輕缺血性損傷發揮腦保護作用[18]。與Lai等[4]報道Sal改善缺血后24 h MCAO大鼠中Bcl-2和Bax比值相吻合，研究發現紅景天苷與pOBz均能改善MCAO大鼠腦組織Bcl-2 /Bax的比值降低，并且pOBz的改善程度與Sal相當，分析可能的原因有：(1)患側半腦除了神經細胞，膠質細胞、內皮細胞也含有Bcl-2和Bax，檢測結果為患側半腦總蛋白結果，pOBz和Sal抑制神經細胞凋亡的結果并未檢測到；(2)線粒體凋亡相關的蛋白不只有Bcl-2和Bax，還有Bad、Bak、Bcl-xl、Mcl-1等其他指標，本研究中并未全部篩選檢測，pOBz表現出優于Sal的神經保護作用，也有可能是通過其他凋亡靶蛋白來抑制MCAO大鼠腦組織凋亡；(3)pOBz對MCAO大鼠的神經保護作用不僅通過改善線粒體誘導細胞凋亡途徑，還可能通過其它途徑，如通過對大腦炎癥的調控，改善腦內炎癥環境來增強對神經的保護作用。

綜上，pOBz給藥2 d可降低MCAO再灌注大鼠的腦梗死體積，改善體質量減輕，具有優于紅景天苷的神經保護作用，該研究為進一步研究pOBz對MCAO大鼠的神經保護作用打下堅實基礎。