多巴胺激活Kv通道抑制胰島素分泌的電生理機制

薛 歡，鐘向琴，劉萌萌，路志紅，溫芝潼，崔麗娟，石曉媛，邢皓杰，趙 昕，張語珊，章 毅

(山西醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，山西 太原 030001)

多巴胺(dopamine，DA)具有調節神經元活性，執行中樞神經系統各種功能的作用，是最重要的神經遞質之一[1]。研究表明多巴胺也可以在胰腺、腎臟和肺等外周組織中合成并釋放，發揮非神經功能[2-3]。目前發現有5種不同的多巴胺受體(DR)亞型(D1R-D5R)，根據生物化學和藥理學特性，分為D1樣受體(D1受體和D5受體)和D2樣受體(D2-D4受體)[4]。臨床研究顯示，長期接受多巴胺前體左旋多巴治療的帕金森氏病患者的糖耐受力明顯降低，發展為2型糖尿病的概率增高[5]。研究表明多巴胺能夠調控葡萄糖刺激的胰島素分泌[6]。電生理的改變是影響β細胞分泌胰島素的重要原因[7]，然而，多巴胺對β細胞電生理的影響目前還沒有系統的研究。本研究通過胰島素分泌實驗、DiBAC4(3)熒光染色、全細胞膜片鉗，研究多巴胺調控胰島素分泌的電生理機制，并深入探討D1樣受體和D2樣受體在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠，♂，體質量(180-250)g，7～8周齡，由山西醫科大學實驗動物中心提供。飼養條件：(20～22)℃，濕度(50±5)%，給予標準嚙齒動物食物及飲用水。生產許可證號：SCXK(晉)2015-0001。

1.2 實驗試劑DA(美國Sigma，批號：11104222)，膠原酶P(瑞士Roche，批號：11104222)，Dispase Ⅱ(美國Amresco，批號：10888700)，血清白蛋白(中國 Solarbio，批號：83100513)，Histopaque-1077(美國Sigma，批號：RNBF 1783)，RPMI 1640培養基(加拿大BBI，批號：E600025)，D-葡萄糖(中國Solarbio，批號：405A0918)，HEPES(中國Solarbio，批號：710B048)，Eticlopride(美國 Sigma，批號：00055132)，Quinpirole(美國Sigma，批號：00069336)，SKF38393(美國Sigma，批號：00055189)。

1.3 實驗儀器CO2細胞培養箱(德國Eppendorf，型號：CellXpert C170i)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，型號：AE2000)，PP-380垂直電極拉制儀(日本Narishige，型號：PP-380)，MF-200微電極拋光儀(日本Narishige，型號：MF-200)，EPC10全自動膜片鉗(德國HEKA，型號：LAMBDA 10-B)。

1.4 實驗方法

1.4.1大鼠胰島和β細胞的制備 首先將SD大鼠斷頭，在無菌實驗臺上剪開腹腔，找到膽總管，然后將含有1 g·L-1膠原酶P(5 mL)的插管插入，胰腺充盈后輕輕剝離，于37 ℃水浴槽中進行約13 min的振蕩消化，離心后棄除上清，加入Histopaque-1077液(10 mL)，離心后挑取分散在分離液中胰島組織。所獲胰島再用Dispase Ⅱ(5 g·L-1)消化約5 min，則得到胰島β細胞。

1.4.2INS-1細胞的培養 大鼠胰島β細胞系(INS-1)購自國家實驗細胞資源共享服務平臺(北京總部)。將INS-1細胞置于含50 μmol·L-1β-巰基乙醇、10%胎牛血清、1%青霉素以及1%鏈霉素的RPMI 1640培養基中，放在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞密度到達80%后，按照1 ∶3比例進行傳代培養。

1.4.3胰島素分泌實驗 配制KRBH溶液和待測樣品溶液，每組標記7個Ep管。首先向每個Ep管中加入500 μL 2.8 mmol·L-1葡萄糖溶液，然后放入5個大小均一且邊緣光滑的胰島，在培養箱內孵育30 min；吸除上清，根據不同實驗要求，分別加入500 μL 2.8 mmol·L-1葡萄糖溶液(即2.8G組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖溶液(即16.7G組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmmol·L-1DA混合液(即16.7G+10 μmol·L-1DA組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmol·L-1SKF38393混合液(即16.7G+10 μmol·L-1SKF組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmmol·L-1Quinpirole混合液(即16.7G+10 μmol·L-1Quin組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmmol·L-1Eticlopride混合液(即16.7G+10 μmol·L-1Eti組)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmmol·L-1DA+10 μmmol·L-1Eticlopride混合液(即16.7G+10 μmol·L-1DA+10 μmol·L-1Eti組)，置于細胞培養箱中孵育30 min；將上清液吸出，保存到對應的Ep管中，4 ℃冰箱保存；各組上清液中胰島素含量通過酶聯放射免疫法檢測。

1.4.4膜片鉗實驗 將培養24 h的β細胞玻片放在浴槽內，在顯微鏡下找到β細胞(≥7 pF)，拋制電極并入液，當電阻增加0.5-1 MΩ時進行高阻封接。在電壓鉗模式下，鉗制細胞膜電位在-70 mV并進行快電容補償，破膜后通過慢電容補償將細胞膜電容調至≥7 MΩ；每10 mV一個步階，記錄在-70 mV～+80 mV電壓刺激下400 ms內的電流。在電流鉗模式下，給予150 pA、4 ms的電流刺激，把從去極化開始到復極化至靜息電位以上10 mV的這段時間作為動作電位時程。

1.4.5DiBAC4(3)熒光染色 DiBAC4(3)是能夠感受電壓變化的熒光染料。將INS-1細胞均勻接種在96孔板中，待細胞密度達到75%左右，更換培養液為2 μmol·L-1DiBAC4(3)熒光染料的2.8 mmol·L-1葡萄糖混合液(現配現用)，于孵箱中培養30 min；孵育結束后用2.8 mmol·L-1葡萄糖溶液清洗；然后依次用16.7 mmol·L-1葡萄糖溶液(即16.7G)和16.7 mmol·L-1葡萄糖+10 μmmol·L-1DA混合液(即16.7G+DA)孵育。使用Cytation 5細胞成像多功能系統(美國BioTek公司)檢測489 nm和525 nm波長下的細胞熒光強度，檢測出的熒光強弱對應于細胞膜電位的大小。

2 結果

2.1 DA對胰島素分泌的影響以及D1樣受體和D2樣受體在其中的作用與基礎葡萄糖(2.8G)相比，高糖(16.7G)明顯促進了胰島素分泌(P<0.01)。與單獨給予高糖相比(16.7G)，DA(16.7G+10 μmol·L-1DA)明顯抑制了胰島素分泌(P<0.01)。分別使用D1樣受體激動劑(SKF38393)和D2樣受體激動劑(Quinpirole)進行干預，結果顯示SKF38393(16.7G+10 μmol·L-1SKF)對胰島素分泌沒有明顯影響；而Quinpirole(16.7G+10 μmol·L-1Quin)明顯抑制了胰島素分泌(P<0.01)。以上結果初步表明DA可能通過D2樣受體發揮抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌作用。見Tab 1。

Tab 1 Effect of DA, SKF38393 and Quinpirole

2.2 D2樣受體阻斷劑Eticlopride對胰島素分泌的影響為了進一步闡明D2樣受體在DA抑制胰島素分泌中的作用，使用D2樣受體阻斷劑(Eticlopride)進行干預。結果顯示Eticlopride(16.7G+10 μmol·L-1DA+10 μmol·L-1Eti)很大程度上消除了DA(16.7G+10 μmol·L-1DA)對胰島素分泌的抑制作用(P<0.01)。結合以上數據表明DA主要通過D2樣受體發揮抑制胰島素分泌的作用。見Tab 2。

2.3 DA對Kv通道的影響及D1樣受體和D2樣受體在其中的作用與對照組相比較，DA(10 μmol·L-1DA)明顯增加了β細胞膜上Kv通道電流(P<0.01)。分別使用D1樣受體激動劑(SKF38393)和D2樣受體激動劑(Quinpirole)進行干預，結果顯示SKF38393(10 μmol·L-1SKF)對Kv通道電流沒有明顯影響；而Quinpirole(10 μmol·L-1Quin)則明顯增加了β細胞的Kv通道電流(P<0.01)。初步表明DA通過D2樣受體抑制Kv通道。見Tab 3和Fig 1。

Tab 2 Effect of Eticlopride on insulin eecretion n=7)

Fig 1 Effects of DA(10 μmol·L-1), SKF38393(SKF,10 μmol·L-1) and Quinpirole(Quin,10 μmol·L-1) on Kv currents of β cells

Tab 3 Effects of DA, SKF38393 and Quinpirole on Kv currents of β cells pA/pF, n=7)

2.4 D2樣受體阻斷劑Eticlopride對β細胞電壓依賴性鉀(Kv)通道的影響為了進一步闡明D2樣受體在DA調控Kv通道中的作用，使用D2樣受體阻斷劑(Eticlopride)進行干預。與單獨給予DA(10 μmol·L-1DA)相比，Eticlopride(10 μmol·L-1DA+10 μmol·L-1Eti)明顯地消除了DA對Kv通道電流的促進作用(P<0.01)。結合以上數據表明，DA主要通過D2樣受體激活Kv通道，進而抑制胰島素分泌。見Tab 4和Fig 2。

Tab 4 Effect of Eticlopride on Kv currents of β cells pA/pF, n=7)

Fig 2 Effect of Eticlopride (Eti,10 μmol·L-1) on Kv currents of β cells

2.5 DA以及D2樣受體阻斷劑Eticlopride對β細胞動作電位時程的影響與對照組相比，DA(10 μmol·L-1DA)明顯縮短了β細胞的動作電位時程(P<0.01)。進一步使用D2樣受體阻斷劑(Eticlopride)干預，結果顯示Eticlopride(10 μmol·L-1DA+10 μmol·L-1Eti)很大程度上消除了DA對β細胞動作電位時程的抑制作用(P<0.01)。見Tab 5。

Tab 5 Effects of DA and Eticlopride on action potential duration of β cells n=7)

2.6 DA對INS-1細胞膜電位的影響結果表明，給予INS-1細胞16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7G)刺激，細胞膜電位明顯升高；而DA(16.7G+10 μmol·L-1DA)干預后，細胞膜電位明顯降低。見Fig 3。

Fig 3 Effect of DA on action potential duration of INS-1 cells (n=3)

3 討論

越來越多的研究表明多巴胺不僅對中樞神經系統有著非常重要的作用，而且還具有調節脂質和葡萄糖代謝的作用。本課題組前期研究認為多巴胺抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[8]，但也有研究表明多巴胺能夠促進胰島素分泌[9]。本次實驗結果顯示多巴胺對高糖(16.7G)刺激下的胰島素分泌有著明顯的抑制作用，與我們前期實驗結果一致，也驗證了Rubí等[10]的研究報道。

多巴胺受體在INS-1E細胞、鼠和人離體胰島組織中也廣泛存在[11]。在本次實驗中，使用D1樣受體激動劑(SKF38393)和D2樣受體激動劑(Quinpirole)特異性激動兩類受體，發現SKF38393干預后胰島素分泌量沒有明顯變化；而Quinpirole則表現出顯著的降低胰島素分泌的作用；Eticlopride特異性阻斷D2樣受體后，發現胰島素分泌增多，多巴胺的作用被明顯削弱。表明多巴胺通過D2樣受體發揮抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌作用。

胰島β細胞是可興奮細胞，電生理的改變是調控其胰島素分泌的重要原因[7,12]。葡萄糖代謝產生的ATP使β細胞膜發生去極化，促使胰島β細胞以胞吐的方式釋放胰島素，值得注意的是電壓依賴性鉀(Kv)通道在細胞膜去極化時也被激活。Kv通道的作用是抑制細胞膜的去極化，是阻礙胰島素分泌的一個重要因素[13-14]。多巴胺能夠影響中樞神經系統中K+、Na+和Ca2+等多種離子通道[15-16]。此外，有報道稱多巴胺可以降低環磷酸腺苷(cAMP)含量[17]。而本課題組前期關于大鼠胰島β細胞的研究發現cAMP信號通路可以通過Kv通道影響胰島素分泌[18]。因此本次實驗著重研究了多巴胺對Kv通道的調控以及兩類多巴胺受體在其中的作用。結果顯示多巴胺明顯增加了Kv通道電流；SKF38393對Kv通道沒有明顯影響，而Quinpirole則明顯增加Kv 通道電流；Eticlopride特異性阻斷D2樣受體后，多巴胺對Kv通道的激活作用被明顯削弱。表明多巴胺通過D2樣受體激活Kv通道。

動作電位是激發β細胞釋放胰島素不可或缺的條件。我們發現多巴胺干預后，β細胞的動作電位時程明顯縮短；進一步使用Eticlopride 特異性阻斷D2樣受體后，β細胞的動作電位時程明顯增加，多巴胺的抑制作用被明顯逆轉。以上表明多巴胺能夠通過D2樣受體縮短β細胞的動作電位時程。此外，DiBAC4(3)染色顯示多巴胺也能夠降低INS-1細胞膜電位。

綜上所述，多巴胺對葡萄糖刺激的胰島素分泌有著明顯的抑制作用，機制是作用于D2樣受體，激活Kv通道，縮短動作電位時程，降低膜電位。本研究有助于更深入理解多巴胺調控胰島素分泌的機制。