基于HK-2細胞的左金丸中生物堿類組分體外毒性篩選及機制初探

楊春啟，連聞雨，林 毅，謝光輝，馬增春，譚洪玲，肖成榮，王宇光，高 月

(1.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；2.軍事科學院軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京 100850；3.廣東藥科大學，廣東，廣州 510006)

經典名方左金丸最早出自于醫學名家朱丹溪撰寫的《丹溪心法》，又被稱之為回令丸，六一丸或茱萸丸[1]。左金丸原方由黃連和吳茱萸兩味單藥按照6:1配伍制成，其具有清肝瀉火，降逆止嘔的功效，臨床主要用于治療肝火犯胃等癥狀[2]。此外，根據黃連和吳茱萸配比不同又被稱為甘露散、反左金丸等[3]。

左金丸在臨床應用廣泛，但研究發現左金丸中單藥黃連能夠誘發并加重新生兒黃疸，新加坡政府于1978年認定其為有毒中藥并嚴禁臨床使用。蔡薇等[4]通過體內實驗認為，黃連能夠明顯降低體內膽堿酯酶活性并產生毒性作用，并且毒性強弱與藥物的品種，使用方法及藥物劑量有關系。黃連中主要生物堿為小檗堿、黃連堿、表小檗堿和小檗紅堿等[5]，其中小檗堿在高脂飲食患者中能夠加重腎臟毒性[6]。此外，左金丸中單藥吳茱萸在藥典中被記錄為小毒中藥，李文蘭等[7]研究表明吳茱萸堿(Evodiamine，EVO)具有潛在的肝腎及胃腸道毒性，臨床報道中由于不當使用吳茱萸而造成的中毒事件也時有發生。周倩等[8]探討吳茱萸中成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯和辛弗林在體外對人胚腎細胞(HEK-293)的影響，結果表明吳茱萸堿[9]、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯均具有潛在腎細胞毒性。因此研究選用左金丸中小檗堿、黃連堿、表小檗堿和小檗紅堿，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內酯和辛弗林8種主要生物堿探討其對HK-2細胞的潛在細胞毒性。

隨著中藥在全球的廣泛發展和使用，中藥安全性問題日益受到關注，其中以馬兜鈴酸事件為主的中藥安全問題嚴重阻礙了中藥發展進程。2020年版《中國藥典》中共收錄馬兜鈴酸在內的52種有毒中藥，腎毒性中藥包括馬兜鈴酸、雷公藤、大黃素以及朱砂等24種藥物。如何驗證和實現中藥的配伍減毒增效，并為助力中藥復方新藥創新和優化提供方法和技術支撐，是中藥腎毒性研究的重要方向。目前左金丸的藥效研究十分廣泛，但其是否具有潛在腎毒性仍研究不足，臨床使用過程中存在潛在風險。為了探究左金丸中是否存在潛在的具有腎毒性的成分，為臨床合理使用提供實驗依據，本研究采用高內涵實驗技術對左金丸及相關組分進行體外腎細胞損傷篩選，并對相關成分可能的腎損傷機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鹽酸黃連堿(批號：112026-201802；94%)小檗堿(批號：110713-201613；86.8%)；吳茱萸堿(批號:110802-201710；99.4%)、吳茱萸次堿(批號：110801-201608；99.7%)、吳茱萸內脂(批號:110800-201707；97.9%)均購于中國食品藥品檢定研究所。辛弗林(CAS:94-07-5)；小檗紅堿(CAS:15401-69-1);表小檗堿(CAS:6873-09-2)購于上海一飛生物科技有限公司，純度均為98%。DMEM培養基(批號：C11995500BT)、0.25% EDTA胰蛋白酶(批號：25200-056)，PBS緩沖液(批號：C10010500BT)均購于Gibco公司。細胞核染料Hoechst33342(H1399)；SYTOXTMGreen Nucleic Acid Stain(S7020)；MitoTrackerTMRed CMXRos(M7512)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。Bax(貨號：2772)、Bcl-2(貨號：3498)和細胞色素C抗體(貨號：12963)購于美國CST公司。KIM-1抗體(貨號：ab228973)購于艾博抗(上海)公司。

免疫染色固定液(批號：P0098)，免疫染色洗滌液(批號：P0106)，免疫染色封閉液(批號：P0102)，一抗稀釋液(批號：P0103)，二抗稀釋液(批號：P0108)，含DAPI防淬封片液(批號：P0131)均購于碧云天生物科技公司。澳洲健康胎牛血清(TransSerum?EQ Fetal Bovine Serum批號：FS201-02), 青霉素-鏈霉素溶液[Penicillin-Streptomycin (100×) 批號：FG101]購于Gibco公司。細胞毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8 批號:CK04)，細胞凋亡試劑盒(批號：AD10)購于北仁化學科技(北京)有限公司。乳酸脫氫酶檢測試劑盒(批號：03004732122)購于羅氏診斷公司。

1.2 細胞培養人腎近曲小管上皮細胞(HK-2，Procell CL-0109))由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，經過STR檢驗合格后使用。細胞接種于豬皮膚膠原蛋白包被后的培養皿中(sigma, NO.48722-500G-F)，于37 ℃，5% CO2條件下進行培養。待細胞培養至密度為80%時，按照1 ∶3傳代，培養于DMEM完全培養基中(10%胎牛血清、1%雙抗)。傳代周期控制在2-3 d/代，實驗選取處在對數生長期細胞進行。

1.3 主要儀器培養箱(美國Thermo公司)；離心機；ImageQuant Las500 型顯影儀(瑞典Healthcare 公司);高內涵分析儀(Molecular Devices公司，ImageXpress Micro Confocal)，高內涵成像系統(Molecular Devices公司，Metaxpress)；羅氏生化儀；PE VictorX型酶標儀(美國Perkin Elmer 公司)；熒光顯微鏡(蔡司公司，型號Vert200)。

1.4 基于CCK-8法的腎細胞毒性篩選通過預實驗確定種板細胞量以及CCK-8孵育時間后進行正式實驗。收集對數生長期腎細胞，根據預實驗結果使用DMEM完全培養基調整細胞濃度，在96孔板中接種調整細胞懸液100 μL/孔，于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養24 h后，選擇黃連中4種單體和吳茱萸中4種單體的不同濃度處理細胞，同時設置陰性對照組。處理細胞的濃度設置及分組如下：

小檗堿(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)；小檗紅堿(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)；表小檗堿(7.5、15、30、60、100 μmol·L-1)；鹽酸黃連堿(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)；吳茱萸堿(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，吳茱萸次堿(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)吳茱萸內脂(12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1);辛弗林(12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1)。每組設置3個復孔，同時設置空白對照，置于37 ℃，5% CO2中處理24 h。孵育完成后棄去培養基，在每孔中加入提前配置的CCK-8工作液(DMEM培養基 ∶CCK-8儲備液=1 ∶9)，根據預實驗摸索條件，將96孔置于培養箱中孵育。使用酶標儀測定96孔白板在450 nm下的吸光度。

計算公式：細胞活力/% = [D(450)待測-D(450)空白對照]/[D(450)正常對照-D(450)空白對照]×100%

1.5 基于高內涵技術的腎細胞毒性篩選將處于對數生長期的HK-2細胞按照“1.2”方法收集細胞并計數，調整細胞濃度為107·L-1，100 μL/孔接種于膠原蛋白包被的黑色96孔板中置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。培養24 h后，棄去原培養液，處理細胞的濃度設置及分組如下：

小檗堿(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)；小檗紅堿(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)；表小檗堿(7.5、15、30、60、100 μmol·L-1)；鹽酸黃連堿(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)；吳茱萸堿(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1)，吳茱萸次堿(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)吳茱萸內脂(12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1);辛弗林(12.5、25、50、100、200、400 μmol·L-1)。每個孔設置3個平行孔，37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。

染料配置：核染料Hoechst用不含血清的DMEM培養基按照1 ∶2 000的比例稀釋10 mmol·L-1細胞核染料，避光保存，備用。SYTOXTMGreen Nucleic Acid Stain染料母液使用前稀釋為1 μmol·L-1工作液避光保存，備用。MitoTrackerTMRed CMXRos染液使用DMSO制備為1 mmol·L-1儲備液避光保存，備用，使用時1 ∶1 000配置使用。

細胞經藥物處理后，棄去原培養液，每孔中加入各配置染料50 μL，置于37 ℃下培養30 min。染料孵育完成后，棄去孔中染料，并在孔中加入已恢復至室溫的細胞固定液固定細胞狀態，置于室溫下孵育20 min。細胞固定后棄去固定液，在孔中加入PBS清洗細胞3次。清洗后每孔中加入200 μL PBS后，使用高內涵成像系統進行檢測。

1.6 EVO對HK-2腎細胞功能(LDH)檢測收集對數生長期腎細胞，使用DMEM完全培養基調整細胞濃度，接種于培養皿中培養24 h后棄去上清，分別使用不同濃度EVO處理腎細胞24 h，同時設置不加藥物組作為Ctrl組。處理后收集上清1 mL于離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，取500 μL上清。使用羅氏cobas c111全自動生化儀(UV法)檢測腎細胞外LDH濃度。

1.7 EVO處理后HK-2細胞形態學變化細胞處理同“1.6”，藥物處理24 h后倒置顯微鏡鏡下觀察EVO不同濃度處理后細胞形態學變化。

1.8 EVO處理后HK-2細胞色素C釋放率變化采用高內涵細胞毒性篩選技術同“2.2”，檢測篩選成分吳茱萸堿處理后HK-2細胞內細胞色素C變化。

1.9 EVO處理后HK-2細胞凋亡變化細胞處理同“2.3”，收集細胞于離心管中，在1 000 r·min-1下離心3 min棄去上清，并重復清洗2～3次。加入預配置的Annexin V Blinding Solution將收集的細胞制成終濃度為109個·L-1的細胞懸液，并按照細胞凋亡試劑盒加入染料后，上機檢測。

1.10 EVO處理后HK-2細胞蛋白表達變化細胞采用同“1.6”處理后采用Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白及腎損傷相關蛋白表達水平，并重復4次獨立實驗。EVO處理后的細胞收集后按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行定量后進行Western blot實驗。實驗采用10% SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉法轉膜后，封閉，孵育一抗、二抗后進行ECL發光顯影。實驗采用GAPDH作為內參蛋白，ImageJ圖像分析軟件進行分析。

1.11 圖像采集與分析采用Metaxpress平臺采集圖像，每孔采集2個視野圖像。圖像采集條件如下：第一孔道于350 nm/461 nm檢測Hoechst33342標記染色；第二通道于491 nm/509 nm檢測Permeability Dye染色；第三通道于551 nm/576 nm檢測Mitochondrial Potential Dye染色。采用ImageXpress Micro Confocal分析系統對獲得的圖片信息導入進行分析。分析條件為細胞數目為第一通道染料熒光數目；DNA密度為第一通道染料熒光強度；細胞膜通透性為第二通道染料熒光強度；線粒體膜電位為第三通道中細胞質與細胞核熒光強度差值。

2 結果

2.1 左金丸中主要單體成分對HK-2細胞存活率的影響CCK-8法對左金丸中8種主要生物堿處理后觀察HK-2細胞24 h后細胞存活率變化，結果如Fig 1所示，左金丸中單藥黃連中主要單體成分小檗堿(Fig 1A)、小檗紅堿(Fig 1B)、鹽酸黃連堿(Fig 1D)在高濃度下具有潛在的腎細胞毒性，并且細胞存活率呈現濃度依賴性降低；黃連中小檗堿未呈現顯著細胞毒性(Fig 1A)。左金丸中另一味單藥吳茱萸中主要成分吳茱萸次堿在高濃度>12.5 μmol·L-1時可能具有潛在的腎細胞毒性，并且細胞存活率呈現濃度依賴性，吳茱萸內酯、辛弗林、吳茱萸堿并未呈現出明顯細胞毒性。上述結果與鏡下觀察結果一致，但EVO處理HK-2細胞活力的檢測結果與鏡下細胞形態觀察結果不一致，3.125 μmol·L-1EVO處理后HK-2細胞形態即發生顯著變化，顯示出一定的細胞毒性，如Fig 4。

2.2 利用高內涵篩選技術檢測左金丸中主要單體成分對HK-2細胞的影響鑒于CCK-8法檢測細胞活力的結果與鏡下細胞形態的改變存在差異，擬采用高內涵技術對左金丸中8種主要單體成分進行腎細胞毒性篩選，結果如Fig 2。左金丸中8種單體處理HK-2細胞24 h后，黃連中小檗紅堿、鹽酸黃連堿和吳茱萸中EVO能夠降低HK-2細胞數目，且EVO在3.2 μmol·L-1時細胞數目減少至59%，并與鏡下細胞形態變化結果一致，如Fig 4。

同時采用高內涵技術，對左金丸中8種單體處理后細胞膜通透性，核DNA密度和細胞線粒體膜電位變化進行檢測, 鹽酸黃連堿(25 μmol·L-1)和吳茱萸堿(0.4 μmol·L-1)能夠升高細胞膜通透性，并呈濃度依賴性，小檗紅堿、表小檗堿處理后HK-2細胞核DNA密度明顯升高。此外，根據數據表明吳茱萸次堿處理后HK-2細胞核DNA密度升高最明顯，結合高內涵圖片采集及分析系統發現，其可能是由于吳茱萸次堿重結晶導致假陽性。對線粒體膜電位檢測發現，鹽酸黃連堿(50 μmol·L-1)、吳茱萸堿(3.2 μmol·L-1)能夠降低線粒體膜電位，并伴隨濃度升高而逐漸降低。綜合上述指標，左金丸中吳茱萸堿在>0.2 μmol·L-1時能夠降低細胞核數目，即存活細胞數降低，顯示出具有潛在的腎細胞毒性，如圖Fig 2E。

Fig 2 Effect of eight alkaloids in Zuojin Pills on HK-2 cell number(A), nuclear DNA density(B), membrane permeability(C), and mitochondrial membrane potential(D); Effect of EVO on nucleus number(E).

2.3 EVO對HK-2細胞功能指標的影響在上述篩選的基礎上，采用EVO處理HK-2細胞24 h后進行細胞功能檢測，結果顯示，EVO在濃度高于0.8 μmol·L-1時，HK-2細胞培養上清中LDH值升高(P<0.01)，且釋放率呈現劑量依賴性。EVO處理后細胞LDH釋放率與鏡下細胞形態及高內涵篩選結果一致,見Fig 3。

Fig 3 Effect of cell function indexes on HK-2 cells

2.4 EVO對HK-2細胞形態的影響倒置顯微鏡鏡下觀察溶劑對照組HK-2細胞為鋪路石狀貼壁生長，加入EVO(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)處理24 h后，隨著藥物濃度升高，細胞貼壁性降低，細胞邊界輪廓清晰，細胞皺縮變圓。高濃度組EVO 100 μmol·L-1時細胞出現破裂，細胞內容物流出，細胞脫落懸浮于培養基中，如Fig 4。

2.5 EVO對HK-2細胞色素C釋放率影響細胞色素C在細胞凋亡中發揮著重要作用。細胞線粒體發生損傷時，細胞色素C由線粒體釋放至胞質中，并引發caspase活化級聯反應誘導細胞死亡。EVO處理24 h后HK-2胞內細胞色素C釋放率顯著升高，并呈濃度依賴性，如Fig 5。

2.6 EVO對HK-2細胞凋亡的影響采用Annexin V/FITC對細胞凋亡進行標記，如圖Fig 6，EVO處理HK-2細胞24 h后細胞凋亡升高，結果與高內涵實驗中細胞色素C表達一致，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 4 The morphological changes of HK-2 cells treated with different concentrations of evodiamine for 24 h(100×)

Fig 5 Changes of cytochrome C release rate in HK-2 cells aftertreatment with different concentrations of EVO

2.7 EVO對HK-2蛋白表達的影響腎損傷分子-1(KIM-1)是一種新型的I型跨膜糖蛋白，當腎受到損傷后能夠迅速升高而特異、靈敏的反映腎損傷情況。Western blot法檢測EVO處理后HK-2細胞中KIM蛋白的表達量，結果表明：隨著EVO濃度升高，HK-2細胞中KIM蛋白表達逐漸升高，如Fig 7。細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2如圖Fig 7，EVO處理后，HK-2細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2表達隨著濃度升高而降低，并呈濃度依賴性，結果與細胞色素C表達相反。

Fig 6 Changes of HK-2 cell apoptosis after treatment withdifferent concentrations of

Fig 7 Changes of protein expression in HK-2 cells treated withdifferent concentrations of

3 討論

腎臟是人體重要的代謝器官，其每分鐘流量約占心搏血流量的1/4。人體內藥物代謝產物及機體廢物會通過血流到達腎臟，并通過腎臟清除有毒外來物和代謝廢物，因此容易由于藥物蓄積導致藥源性腎損傷。藥源性腎損傷最早被發現于20世紀90年代，截至2019年5月1日《中國藥品不良反應信息通報》統計共162種藥物，其中中藥類藥物有52種(32.1%)。中藥中有32種存在腎毒性風險，占所有不良反應的61.5%[10]。目前中藥已出口到包括美國、日本和印度等175個國家和地區，而與中草藥相關的藥源性腎損傷包括急性腎損傷、慢性腎病、腎結石、橫紋肌溶解癥、范可尼綜合征和尿路上皮癌等，但確切作用機制尚不清楚[11]。Ye等[12]針對馬兜鈴酸誘導的腎臟損傷機制研究發現，馬兜鈴酸除了通過與DNA形成絡合物產生腎毒性外，還可能通過異常激活補體系統中C3a和其受體C3aR誘導TGF-β1表達升高，調控腎細胞纖維化相關通路。早期藥源性腎損傷由于藥物毒性低或者蓄積量少通常難以發現，臨床診斷難度大，容易延誤診治，最終發展為不可逆的腎損傷[13]。近年來針對中藥腎損傷研究逐漸深入， 采用血清肌酐和尿素氮作為腎臟損傷的標準生物標志物，其敏感性和特異性較低已經不能夠滿足臨床需求。Kagawa等[14]采用下一代測序分析對血清中miR-143-3p和miR-122-5p進行特異性檢測，發現其表達下調，且變化明顯早于血清肌酐和尿素氮。

目前毒理學研究主要采用MTT、臺盼藍染色、結晶紫以及CCK-8等傳統細胞毒性檢測方法，然而傳統檢測手段由于其通量低、檢測效率慢、細胞毒性高和易受藥物自身性質影響等缺點嚴重阻礙了毒理學研究進程。高內涵篩選分析技術是一種將目的細胞進行特異性染色，并通過高分辨率成像、自動化分析系統以及數據分析系統獲取細胞詳細生長狀態的技術。在細胞水平，對不同處理后的細胞利用顯微成像技術記錄細胞熒光圖像及熒光強度變化，能夠高通量、精準化進行分析檢測，極大提高工作效率。該技術彌補了目前現有的發現毒理學檢測方法在通量、檢測毒性物質機制、揭示潛在毒性等方面的不足，這為藥物的腎毒性篩選提供了更為方便、快捷的方法。目前高內涵技術運用于發現藥物、功能基因組學(如前導化合物優化、化合物庫富集等)、毒理學研究(發育毒性、遺傳毒性、神經毒性、肝毒性、心臟毒性和腎毒性等)等方面，極大的促進藥物發現，并在開發藥物以及簡化毒理學研究中具有重要意義，是21世紀毒性測試的有力工具。

本實驗基于HK-2細胞對左金丸中所含的8種主要單體成分(小檗堿、小檗紅堿、鹽酸黃連堿、表小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內脂、辛弗林)的腎細胞毒性進行初步篩選。研究首先采用CCK-8法對左金丸中8種單體進行篩選，小檗堿、小檗紅堿、鹽酸黃連堿在高濃度具有潛在腎細胞毒性，其他五種單體成分未顯示出腎細胞毒性，但EVO處理后細胞形態學結果與CCK-8細胞活力的結果存在一定偏差。相關研究提示吳茱萸中生物堿清除羥基自由基能力和二苯代苦味酰基自由基強于Vc，其還原能力隨藥物濃度升高而增強，可能影響CCK-8檢測細胞活力結果[15-16]。進一步采用高內涵技術對左金丸中八種單體成分進行篩選，通過對EVO處理后HK-2細胞數目、核DNA密度、細胞膜通透性、線粒體膜電位以及細胞色素C釋放率進行檢測篩選，結果表明黃連中小檗紅堿、鹽酸黃連堿在高濃度時具有潛在的腎細胞毒性，與細胞活力結果一致。吳茱萸中EVO在0.2 μmmol·L-1時使細胞核數目降低，核DNA密度不變，細胞膜通透性明顯升高，線粒體膜電位降低，同時細胞色素C釋放率隨EVO濃度升高而增加。進一步研究發現，EVO處理后細胞LDH釋放率呈現濃度依賴性升高。Western blot實驗結果顯示EVO能夠誘導細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達進而造成腎細胞損傷。

通過CCK-8和高內涵技術我們對左金丸中的8種成分進行了初步的篩選，并對細胞毒性各項指標明顯的吳茱萸堿前期進行了相對全面的研究。研究提示左金丸中具有潛在腎細胞毒性成分為吳茱萸堿(EVO)，在配伍組方和組分減毒過程中應關注該成分可能存在的腎臟毒性，通過配伍減毒等技術手段降低其發生不良反應的風險。但由于中藥的毒性問題不可能也不應該是單一成分所能夠主導的，因此其他相關成分的毒性后續研究中將更加綜合和全面的考察，特備是組分配伍條件下的毒性變化，相關工作正在進行中，仍需要深入研究。