基于網絡藥理學及分子對接探討二至天癸方治療女性不孕癥的作用機制

李 然 ，郭 穎

(山東中醫藥大學1.研究生院，2.附屬醫院生殖中心婦二科，山東 濟南 250014)

不孕癥是指性生活正常,一年未采取任何避孕措施而未成功妊娠者，是女性常見的生殖疾病。近些年隨著二胎政策的全面開放，高齡女性的生育問題受到越來越多的關注。然而，先前的研究表明，女性的生育能力普遍會隨著年齡的增長逐漸下降[1]，高齡人群只能借助輔助生殖技術以期獲得妊娠。在助孕技術中，由于高齡患者卵巢反應低下、子宮內膜容受性較差、血流量不足，不能募集到優質卵母細胞，從而導致妊娠率降低而流產率升高。很多高齡女性尋求中西醫聯合治療，以提高卵巢功能，改善內膜血流，提高受孕率。

中醫認為，卵泡的生長發育和成熟均伴隨著人體腎氣、腎陰(腎精)的耗損，高齡女性腎之精氣逐漸衰退，肝腎虧虛、氣血不足、沖任虛衰，則孕育無能。二至天癸方組成包括菟絲子、女貞子、枸杞子、旱蓮草、熟地、當歸、白芍、川穹、香附、甘草。十味之方聯合使腎氣足、精血旺、沖任暢順，在多卵泡發育中有針對性的補腎益陰,增加腎陰癸水的儲備。連方等[2]通過臨床試驗證明，二至天癸方能提高高齡人群的卵子質量，有效抑制顆粒細胞的凋亡，改善腎虛狀態，提高胚胎的種植率。

網絡藥理學是一種新興的生物信息學研究方法，可以根據目標分子、生物功能和生物活性化合物等生成復雜的相互作用網絡，研究中藥復方作用機理，解釋生物系統與藥物之間的復雜關系，篩選多種藥物的協同效應[3]。分子對接是基于受體和配體的空間結構的對接,能快速預測中藥活性成分與靶點之間的結合力。為此，本研究基于網絡藥理學方法，探討二至天癸方治療女性不孕癥的分子機制，同時將篩選出的主要化學成分與Mfn-1和Mfn-2進行分子對接結合驗證，為中醫藥治療高齡女性不孕癥提供先導信息和基礎。

1 材料與方法

1.1 二至天癸方相關靶點篩選利用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)尋找中藥化學組成成分，根據口服利用度OB≥30%，且類藥性DL≥0.18進行活性成分初步篩選，并結合相關文獻以獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點。篩選結束后，統一在Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)標準化蛋白質靶點信息。

1.2 女性不孕癥相關靶點篩選以“Female infertility”為關鍵詞，檢索GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、TTD數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd) 、OMIM數據庫(http://www.omim.org)中治療女性不孕癥的作用靶點，進入DRUGBANK數據庫(https://www.drugbank.ca)尋找治療女性不孕癥的臨床一線西藥作用靶點。由于Genecards數據庫中靶點太多，取Score分值大于中位數的靶點為治療女性不孕癥的潛在靶點。將4個疾病數據庫靶點合并刪除重復值之后，獲得女性不孕癥靶點。

1.3 成分-疾病靶點PPI網絡構建為明晰二至天癸方藥物相關靶點與女性不孕癥靶點間的相互作用，應用聯川生物圖文工具(https://www.omicstudio.cn/tool)將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。而后將篩選出的交集靶點導入STRING11.0b數據庫(https://string-db.org) ，設定生物種類為人類，最小互相作用閾值設定>0.9，其他設置均默認，構建PPI網絡。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖的構建將藥物活性成分及“1.3”得到的交集靶點分別導入CytoScape3.8.0，得到“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，利用插件內置的“Network Analyzer”分析有效成分，圖中節點越大代表度值越大，依據結點的度值分析發揮藥物作用的核心靶點和主要有效成分。

1.5 二至天癸方成分-女性不孕癥靶點功能與通路的富集分析Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html)具有全面的注釋靶點信息功能，并每月更新基因注釋數據。將獲得的交集靶點錄入Metascape數據庫，設定P<0.01進行富集分析，保存數據結果并采用微生物圖文工具(http://www.bioinformatics.com.cn)對數據進行可視化，得到GO和KEGG富集分析的柱狀圖、氣泡圖和通路圖，分析其參與的主要生物學通路及代謝過程。并在MCODE模塊對網絡進行聚類分析，得到密度較高的區域，通過研究其參與的主要生物學過程分析其功能。

1.6 分子對接驗證分子對接結果可顯示中藥活性成分與重要靶蛋白之間的結合活性, 對網絡藥理的分析結果起到一定的驗證作用。從TCMSP數據庫下載二至天癸方主要活性成分的mol2結構文件，從PDB數據庫下載高分辨率Mfn-1(PDBID：5GOF)和 Mfn-2(PDBID：6JFK)。然后用Pymol2.5.0對蛋白分子去水、加氫、計算電荷，保存成pdbqt文件。應用Autodock 4.2.6對接小分子和蛋白質，選用獲得最高分的構象，整理結果并通過Pymol 2.5.0進行可視化。

2 結果

2.1 二至天癸方活性成分靶點的獲取在TCMSP數據庫中經篩選，并結合文獻數據[4]，獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點。其中女貞子成分8種，作用靶點194個；枸杞子成分36種，作用靶點199個；川芎成分6種，作用靶點29個；白芍成分8種，作用靶點89個；熟地黃成分2種，作用靶點31個；甘草成分88種，作用靶點228個；當歸成分2種，作用靶點52個；香附成分16種，作用靶點221個；菟絲子成分10種，作用靶點210個；旱蓮草成分10種，作用靶點176個。合并去重后共獲得中藥活性成分159種，蛋白質靶點283個。

2.2 女性不孕癥相關靶點的獲取從Genecards平臺共獲得1 994個作用靶點，取Score分值大于中位數6.95的1 001個靶點作為治療女性不孕癥目標靶點。合并TTD數據庫靶點5個、OMIM數據庫靶點132個、DRUGBANK數據庫靶點30個，去重后最終得到女性不孕癥靶點1 078個。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖的構建將篩選的二至天癸方中藥成分靶點與女性不孕癥疾病靶點取交集，利用聯川生物圖文工具繪制韋恩圖，得到交集靶點104個，見Fig 1。在CytoScape軟件中導入二至天癸方的中藥成分和104個交集靶點，去除與靶點無相互作用的成分，得到“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。通過CytoScape3.8.0內置的Network Analyzer分析二至天癸方治療女性不孕癥網絡拓撲學參數，度值越大說明該成分越重要,在154個相互作用活性成分的網絡中，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芒柄花素(formononetin)、柚皮素(naringenin)、金合歡素(acacetin)、異鼠李素(isorhamnetin)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)均能與15個以上的靶點相連接，推測這9個成分是二至天癸方治療女性不孕癥的核心成分，見Tab 1。在“藥物-成分-靶點-疾病”網絡中PTGS2的連接度為111，介度為0.151 9，緊密度為0.571 4，預測PTGS2為二至天癸方調治女性不孕癥的最主要靶點。ESR1、HSP90AA1、AR、NOS2、PPARG、NCOA2、CCNA2、PRKACA、ADRB2等均可作用于30種以上的成分，亦為相對重要的靶點。故二至天癸方可能同時作用于多個靶點共同治療女性不孕癥。

Fig 1 Ingredients of Erzhi Tiangui formula-target of female infertility Venn diagram

Tab 1 Characteristic parameters of network nodes of main active components of Erzhi Tiangui formula

2.4 PPI網絡的構建將靶點提交至STRING11.0b平臺，得到二至天癸方治療女性不孕癥的PPI網絡，見Fig 2。在STRING網絡圖中STAT3、HSP90AA1、VEGFA、ESR1、AR、PRKACA、PPARG、NCOA2、PTGS2、NOS2度值均大于中位數6，將兩圖的主要靶點相互映射，推測二至天癸方的有效成分可能通過HSP90AA1、ESR1、AR、PRKACA、PPARG、NCOA2、PTGS2、NOS2等靶點發揮治療女性不孕癥的作用。一種活性成分可以對多個靶點發揮作用，而同一靶點又可同時受多種成分的調控，體現了二至天癸方系統、綜合、復雜的調節能力。

Fig 2 PPI network of Erzhi Tiangui prescription-female infertility target

2.5 靶點功能與通路的富集分析通過Metascape數據庫對二至天癸方治療女性不孕癥交集靶點進行生物通路過程分析，應用微生物網站對結果可視化。主要參與的生物學過程包括細胞對有機環化合物的響應、對無機物的反應、活性氧代謝過程、對氧化應激的反應、細胞對氧化應激的反應、對活性氧的反應，對細胞增殖的負調控，見Fig 3A。參與治療的有關通路主要有PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、以及內分泌抵抗等，見Fig 4。生物通路過程富集靶點見Tab 2。

Tab 2 Enrichment targets in process of biological pathway of Erzhi Tiangui prescription in the treatment of female infertility

相關靶點治療女性不孕癥的功能主要富集于細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體調節活性、受體配體活性、生長因子受體結合，生長因子活性等，見Fig 3C。

利用Metascape數據平臺的 MCODE模塊，獲得網絡中的高度連通區域(子網)，進行模塊劃分，見Fig 5。根據P值, 篩選出3個生物學進程，見Tab 3。

Tab 3 Functional description of network for Erzhi Tiangui formula- female infertility targets

2.6 分子對接驗證分子對接配體與受體間，若結合能小于0提示可自發結合。且結合能越低，其結合構象越穩定，小分子化合物與蛋白越有可能產生作用。一般認為分值小于-5 kJ·mol-1時，分子與靶點可以較好結合。依據“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖的節點度值排名并查閱相關文獻,課題組將齊墩果酸與9種主要活性成分作為研究對象，分子對接結果顯示：齊墩果酸、β-谷甾醇、芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、山奈酚等與Mfn-1對接分數較高，β-谷甾醇、齊墩果酸，金合歡素等與Mfn-2對接分數較高，見Tab 4。

Fig 3 Enrichment analysis of potential targets of main components in Erzhi Tiangui prescription A:GO-BP analysis; B:GO-CC analysis; C:GO-MF analysis

Fig 4 Bubble diagram of KEGG pathway

3 討論

隨著年齡的增長，婦女體內能量代謝過程漸趨失調，糖、脂代謝受損，炎癥和氧化應激的發生率逐漸增加。本研究通過“藥物-成分-靶點-疾病”網絡初步篩選出二至天癸方調治女性不孕癥的活性成分為齊墩果酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素等。現代藥理研究表明，齊墩果酸能調節內分泌環境，改善胰島素抵抗，降低四氧嘧啶糖尿病大鼠的MDA水平，發揮明顯的抗氧化作用[5]。槲皮素具有抗炎、鎮痛、抗癌、抗缺氧損傷、抗血小板凝聚、降血壓、保護動脈粥樣硬化等功能[6]，有利于改善卵細胞的質量以及促進胚胎的著床與發育。木犀草素具有抗氧化、抗炎及免疫調節等多種作用，促進妊娠[7]。山萘酚可抑制AGE的形成并消除自由基, 其強大的抗氧化作用，可防止細胞內脂質和DNA的氧化損傷[8]。β-谷甾醇可增強酪氨酸磷酸酶活性,減小促炎因子和趨化因子活性,抑制NF-κB因子向細胞核遷移發揮抗炎功效，并通過抑制膽固醇合成酶HMGCoA的表達,減少機體膽固醇合成[9]。芒柄花素具有植物雌激素樣作用，能夠在體外條件下增強T47D細胞ERα表達,還可以調節體內血脂代謝[10]。分子對接結果亦表明齊墩果酸、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素均能與Mfn-1較好結合，齊墩果酸、β-谷甾醇、芒柄花素均能與Mfn-2較好結合,一定程度上驗證了這項研究的結果。

Fig 5 Erzhi Tiangui formula-subnet in network of female infertility targets

Tab 4 Molecular docking with high scores of potential targets and corresponding compounds in Erzhi Tiangui Formula

該研究結果表明，二至天癸方治療女性不孕癥的主要作用靶點為PTGS2，而ESR1亦發揮了重要作用。卵丘細胞中PTGS2的高表達與人類卵母細胞能力獲得和更高級別胚胎的獲得有關；同時PTGS2編碼COX-2酶，在卵丘細胞中的COX-2水平被證實可以擴張卵丘和成熟卵母細胞,因此PTGS2與卵母細胞質量密切相關[11]。ESR1基因編碼雌激素受體，雌激素及其受體在生殖器官的發育和成熟及生殖功能中發揮極其重要的作用[12]。

高齡女性卵泡液蛋白質組學代謝功能總體趨勢是細胞凋亡加劇，增殖與分化修復能力下降，從而導致卵泡凋亡加速、卵細胞質量下降，使高齡女性受孕率降低而自然流產率升高。二至天癸方調治女性不孕癥的通路主要有PI3K-Akt信號通路(hsa04151)、MAPK信號通路(hsa04010)等。PI3K/AKT途徑參與卵母細胞生長、原始卵泡發育、顆粒細胞增殖和凋亡。Bax和Bcl-2是線粒體凋亡路徑中的關鍵蛋白，已被證明調節卵巢中的凋亡[13]。Bax蛋白位于細胞質中，可以轉運到線粒體膜上，形成線粒體孔道，促進細胞色素C釋放，導致細胞凋亡。Bcl-2表達上調可拮抗Bax促凋亡的作用，并抑制顆粒細胞凋亡[14]。caspase-3是多種凋亡途徑的共同作用點, 也是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路, 被認為是凋亡的最終執行者[15]。二至天癸方可能通過抑制PI3K/AKT途徑抑制Bax、caspase-3，促進Bcl-2的上調抑制凋亡路徑。

MAPK信號通路在細胞生長、遷移、增殖、分化和凋亡方面發揮著關鍵作用。MAPK超家族包括經典的MAPK(又稱ERK)、JNK和p38 3個成員。有學者發現，JNK參與過氧化氫處理后FoxO4中T451和T447的磷酸化，并且可促進氧化應激中FoxO1的核轉位誘導的mGCS細胞(小鼠卵泡顆粒細胞)凋亡[16]。ERK和p38αMAPK也在卵母細胞減數分裂成熟[17]和卵母細胞激活[18]中起重要作用，靶向該途徑可成為治療高齡女性不孕癥的有效策略。

綜上所述，本研究通過采用網絡藥理學探索二至天癸方中活性成分、潛在靶點、通路過程，并運用分子對接技術分析了主要活性成分與Mfn-1、Mfn-2的結合能力。從整體性、系統性來分析二至天癸方多成分、多途徑、多靶點協同作用原理，為高齡女性不孕癥的中醫藥治療提供了先導信息和基礎。本研究的不足之處在于,未考慮各味中藥的量以及煎煮時發生的化學反應及體內的代謝過程。同時分子對接也是計算機結果，還不能取代實驗數據，后期可用實驗加以驗證。