基于網絡藥理學方法和分子對接技術探討肝豆靈治療肝豆狀核變性認知障礙的作用機制

趙晨玲，董 婷，楊文明，江張勝，田麗偉

(安徽中醫藥大學1.研究生院，安徽 合肥 230038；2.第一附屬醫院,安徽 合肥 230031)

肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson病(Wilson disease，WD)，是一種ATP7B基因缺陷所致的慢性進行性銅代謝障礙性疾病，全球平均患病率約為1/30 000，認知障礙是其主要的神經癥狀[1]。目前現代醫學在治療WD認知障礙方面尚無特效方法，一般用藥包括銅螯合劑和腦細胞活化劑等，此類藥物雖可在一定程度上緩解患者的相關癥狀，但存在副作用大、療效欠佳等問題，從而限制了其臨床應用[2]。中藥復方因其副作用小，且具有多成分、多靶點、多通路的特點，近年來逐漸成為WD認知障礙防治的研究熱點。

肝豆靈是安徽中醫藥大學第一附屬醫院所創制的具有自主知識產權的院內制劑，由丹參、莪術、姜黃、雞血藤、黃連、生大黃六味中藥組成[3]。該方重用姜黃、黃連為君，活血行氣、化痰燥濕，取“治痰先治氣，氣順痰自消”之意；以丹參、莪術、雞血藤為臣，活血化瘀，軟堅散結，通經活絡以祛銅濁毒邪外出；佐以大黃通腑利濕、排銅解毒。諸藥合用，共奏行氣活血、化痰祛瘀、排銅解毒之功。臨床研究表明，肝豆靈可顯著改善WD引起的認知障礙[4]，但其作用機制尚待明確。

近年來，網絡藥理學的興起為中藥復方的作用機制研究提供了新的方向[5]，其可通過構建中藥復方與疾病間的“化學成分-交集靶點”多向性網絡，進而從分子層面揭示兩者之間的關聯作用。基于此，本研究依托網絡藥理學方法及分子對接技術，旨在探討肝豆靈治療WD認知障礙的作用機制，以期為今后肝豆靈的實驗研究及臨床應用提供新的理論支撐。

1 方法

1.1 肝豆靈化學成分篩選及潛在靶點預測通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫，分別以肝豆靈中各單味中藥的名稱(丹參、莪術、姜黃、雞血藤、黃連、生大黃)為關鍵詞進行檢索，其中生大黃按大黃進行檢索，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為過濾條件，篩選出肝豆靈中各單味中藥的有效化學成分及其相對應的潛在靶點，并利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫，將所獲靶點名稱轉換成標準基因名，從而得到肝豆靈的基因靶點。

1.2 疾病相關靶點獲取通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數據庫，以“cognitive impairment in Wilson disease”為關鍵詞，檢索與WD認知障礙相關的作用靶點，并將所獲靶點進行合并去重。

1.3 交集靶點篩選及“化學成分-交集靶點”網絡構建將肝豆靈的基因靶點和WD認知障礙的疾病靶點上傳至Veen在線作圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行Veen分析后，得到其交集靶點名稱。利用Cytoscape 3.8.0軟件構建肝豆靈與WD認知障礙間的“化學成分-交集靶點”多向性網絡圖并篩選出其核心節點。

1.4 蛋白質與蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及核心靶點篩選將肝豆靈與WD認知障礙的交集靶點導入到String(https://www.string-db.org/)數據庫中進行PPI分析，限定物種為Homo Sapiens，設置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，構建PPI網絡圖，下載對應的tsv文件并將其導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，應用CytoNCA插件計算各節點的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，對結果進行拓撲分析后得到關聯度最大的靶點，即為核心靶點。

1.5 基因本體(GO)生物功能和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析借助DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫進行GO生物功能和KEGG通路富集分析(選取條件為P<0.05)，并利用R 4.0.3軟件所獲結果進行可視化處理，繪制條形圖及氣泡圖，以期從生物功能和信號通路的角度分析肝豆靈治療WD認知障礙可能的作用機制。

1.6 分子對接將度值排名前3的核心靶點與其對應的化學成分進行分子對接。利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化學成分的小分子配體文件，將其導入到Chem3D軟件中進行空間結構轉化及能量優化后，輸出為mol2格式文件，再經AutoDockTools 1.5.6軟件處理后將文件保存為pdbqt格式。從Uniprot數據庫檢索核心靶點的基因ID，并在PDB數據庫(http://www1.rcsb.org/)下載其所對應的PDB格式文件，經Pymol軟件進行水分子去除及受配體分離后，將所獲核心靶點的大分子受體文件導入到AutoDockTools 1.5.6軟件進行加氫處理并以pdbqt格式進行文件保存。借助Autodock vina 1.1.2軟件將核心靶點及其對應的化學成分進行分子對接，并以結合能作為對接評價指標。

2 結果

2.1 肝豆靈化學成分篩選及潛在靶點預測結果通過TCMSP數據庫共收集得到肝豆靈的化學成分146個，其中丹參65個，莪術3個，姜黃24個，雞血藤24個，黃連14個、大黃16個，化學成分-潛在靶點一一對應后得到肝豆靈的有效化學成分118個(Tab 1列出OB值排名前20位的有效化學成分)，對應潛在靶點254個，利用Uniprot數據庫將所獲靶點名稱轉換成標準基因名，合并去重后共得到肝豆靈的基因靶點218個。

2.2 疾病相關靶點篩選結果通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD數據庫，以“cognitive impairment in Wilson disease”為關鍵詞進行檢索，將所獲靶點進行合并去重后，得到與WD認知障礙相關的作用靶點4 858個(Fig 1)。

Fig 1 Target map of cognitive impairment in WD

2.3 交集靶點篩選及“化學成分-交集靶點”網絡構建結果將218個肝豆靈的基因靶點和4 858個WD認知障礙的疾病靶點上傳至Veen在線作圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行Veen分析后，共得到交集靶點189個(Fig 2)。利用Cytoscape 3.8.0軟件構建肝豆靈與WD認知障礙間的“化學成分-交集靶點”多向性網絡。結果顯示，網絡共包含284個節點及1 221條邊，其中肝豆靈化學成分節點95個，交集靶點節點189個。以大于節點度值中位數的2倍作為篩選條件，得出槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、丹參酮ⅡA(tanshinone iia)為度值排名前3的化學成分，其度值依次為108、50、37，這些化學成分可能在肝豆靈治療WD認知障礙中起著關鍵作用。

Fig 2 Veen map of Gandouling and cognitive impairment in WD

Tab 1 Prediction results of effective chemical components of Gandouling (Top 20 in OB value)

2.4 PPI網絡構建及核心靶點篩選結果將189個肝豆靈與WD認知障礙的交集靶點導入到String數據庫中進行PPI分析，限定物種為Homo Sapiens，設置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，構建PPI網絡。結果顯示，網絡共包含188個節點及790條邊，平均節點度值為8.4。下載對應的tsv文件并將其導入到Cytoscape 3.8.0軟件中，應用CytoNCA插件計算各節點的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，并對結果進行拓撲分析后，最終得到關聯度最大的前14個靶點，依次為JUN、STAT3、TP53、MAPK1、MAPK14、MYC、IL6、TNF、RB1、CCND1、AKT1、EGFR、RELA、CXCL8(Fig 3)，這些靶點可能是肝豆靈治療WD認知障礙的核心靶點。其中，JUN、STAT3、TP53為度值排名前3的靶點。

Fig 3 Core target network of Gandouling in treatmentof cognitive impairment in WD

2.5 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析結果借助DAVID數據庫進行GO生物功能富集，結果得到GO條目2 922個，其中生物過程(BP)條目2 555個，細胞組成(CC)條目122個，分子功能(MF)條目245個(選取條件為P<0.05)。由于P值代表富集顯著性，故選取BP、CC、MF中P值最小的前10個條目，利用R 4.0.3軟件制作成GO生物功能富集條形圖及氣泡圖(Fig 4、Fig 5)。結果顯示，肝豆靈與WD認知障礙交集靶點基因的BP主要集中在藥物反應(response to drug)、金屬離子反應(response to metal ion)、氧化應激反應(response to oxidative stress)等；CC主要集中在膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、膜區(membrane region)等；MF主要集中在DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。

Fig 4 Go biological function enrichment bar chart of Gandoulingin treatment of cognitive impairment in WD

Fig 5 Go biological function enrichment bubble chartof Gandouling in treatment of cognitive impairment in WD

借助DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，結果得到KEGG信號通路175條。由于P值代表富集顯著性，故選取P值最小的前30條信號通路，利用R 4.0.3軟件制作成KEGG信號通路富集條形圖及氣泡圖(Fig 6、Fig 7)。結果顯示，肝豆靈與WD認知障礙交集靶點基因的信號通路主要涉及PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、脂質與動脈粥樣硬化信號通路(lipid and atherosclerosis)等。

2.6 分子對接結果將“2.4”項中度值排名前3的核心靶點與其對應的化學成分進行分子對接(見Tab 2)。結果顯示，核心靶點與其對應的化學成分之間均有較強的相互作用，其中JUN與槲皮素的結合性最好，運用Pymol軟件對其進行可視化分析(Fig 8)。從Fig 8可以看出，JUN主要通過Arg263、Asn262兩個氨基酸殘基與槲皮素發生H鍵作用，氫鍵的結合能為-9.2 kcal·mol-1。

Fig 6 KEGG signal pathway enrichment bar chart of Gandoulingin treatment of cognitive impairment in WD

Fig 7 KEGG signal pathway of Gandouling in treatmentof cognitive impairment in WD

Fig 8 2D map of interaction between Jun and QuercetinTab 2 Virtual docking results of core target-chemical components of Gandouling in treatment of cognitive impairment in WD

Core targetPDB IDChemical compositionBinding energy/kcal·mol-1JUN5T01rhein -9.0JUN5T01beta-sitosterol-1.7JUN5T01luteolin-8.9JUN5T01tanshinone iia-8.8JUN5T01quercetin-9.2JUN5T01formononetin-8.6STAT36NUQcryptotanshinone-8.8STAT36NUQlicochalcone a-7.9TP53 7BWNaloe-emodin-8.4TP53 7BWNluteolin-8.6TP53 7BWNtanshinone iia-8.3TP53 7BWNquercetin-9.1

3 討論

WD認知障礙雖在中醫典籍中并無相對應的病名記載，但依據其臨床表現，一般可將其歸屬于“健忘”“善忘”“呆病”等范疇。中醫認為，痰瘀互結是本病最主要的證候特征，其發病機制為“銅毒內蘊，痰瘀阻絡”。肝豆靈作為化痰祛瘀法的典型院內制劑，經臨床研究證實，其對清除WD患者腦部沉積銅有積極作用，可有效改善其神經病變[6]；同時,動物實驗亦表明，肝豆靈可降低WD模型TX小鼠神經細胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平[7]，并可阻止炎癥小體激活，具有抑制神經細胞凋亡，改善認知障礙的作用[4]。

本研究發現，槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA等化學成分是與WD認知障礙相關靶點作用最多的化學成分，提示其可能與肝豆靈治療WD認知障礙密切相關。有文獻報道，槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA均可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種途徑來發揮其神經保護的效用[8-10]。槲皮素可減緩認知障礙細胞模型和動物模型的病理進程[11-12]，其作用機制可能與抑制海馬TLR4/NF-κB信號通路，阻斷炎癥因子參與的“級聯事件”及增加AKT信號通路中AKT蛋白磷酸化的程度，減輕海馬神經細胞凋亡有關[8,13]。木犀草素可通過調節機體的抗氧化系統，降低ROS水平，減輕炎癥反應，增強突觸傳遞，減少認知障礙大鼠在Morris水迷宮試驗中的逃避潛伏期，改善記憶能力，提高認知功能[9]。丹參酮ⅡA可降低海馬組織中Tau蛋白過度磷酸化及β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)過度沉積，并可通過激活PI3K-AKT信號通路，抑制神經細胞凋亡，促進神經細胞的修復和再生[14]。

PPI網絡分析結果顯示，JUN、STAT3、TP53為PPI網絡中度值排名前3的靶點，提示其可能是肝豆靈治療WD認知障礙的核心靶點。研究表明，JUN、STAT3及TP53均具有誘導神經細胞凋亡的作用，其機制可能與Tau蛋白的過度磷酸化、Aβ的過度激活及炎癥因子的介導有關。目前，對于肝豆靈治療WD認知障礙的實驗研究多集中在測定IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達上，而對于JUN、STAT3、TP53改善WD認知障礙，發揮神經保護的作用機制臨床卻鮮有報道，故需進一步實驗驗證。

結合GO生物功能富集結果及相關文獻可知，大量銅離子蓄積于腦，可提高腦組織中ROS水平，引發氧化應激反應[7]。氧化應激信號匯集到下游，可促使caspase-3活化并對AKT進行剪切，抑制PI3K-AKT信號通路傳導，導致Tau蛋白過度磷酸化及Aβ過度沉積，同時激活相關轉錄因子的轉錄活性，誘導神經細胞凋亡，進而影響認知功能[15]。KEGG通路富集結果顯示，肝豆靈治療WD認知障礙的核心通路主要涉及PI3K-AKT、AGE-RAGE信號通路等。PI3K-AKT信號通路可通過誘導細胞自噬，促進海馬神經細胞內Aβ的清除及Tau蛋白的去磷酸化，減輕神經突觸損傷，增強神經突觸形態，抑制海馬神經細胞凋亡，改善學習記憶能力[15]；AGE-RAGE信號通路可通過觸發機體氧化應激及神經炎癥反應[16-17],促使海馬神經細胞凋亡，導致認知功能損害[18]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法和分子對接技術，探討了肝豆靈治療WD認知障礙的作用機制，發現肝豆靈的主要化學成分槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA等可能作用于JUN、STAT3、TP53等核心靶點，并通過PI3K-AKT、AGE-RAGE等信號通路來降低ROS水平，減輕炎癥反應，抑制神經細胞凋亡，發揮其保護神經細胞、改善認知功能的效用，表現出多成分、多靶點、多通路的作用特點，為今后的實驗研究及臨床應用提供了新的理論支撐。