補(bǔ)陽還五湯通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路調(diào)控自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷

馬秀娟，趙艷萌，王文良，靳曉飛，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

缺血性腦卒中臨床常用的治療手段是血管內(nèi)溶栓[1]，但是腦組織恢復(fù)血流灌注后常發(fā)生缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷。腦IR損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞水腫、壞死，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括自由基增多、炎癥反應(yīng)、鈣超載、自噬等[2]。AMPK是以上機(jī)制的交叉口，可被多種因素激活，活化的AMPK可啟動AMPK/mTOR/ULK1信號通路，從而激活細(xì)胞自噬[3]。多項(xiàng)研究表明補(bǔ)陽還五湯可通過調(diào)控自噬發(fā)揮抗腦IR損傷作用[4-7]，但對于補(bǔ)陽還五湯是否可通過AMPK/mTOR/ULK1自噬信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚未見相關(guān)報道。本課題組經(jīng)離體實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)陽還五湯可通過該自噬信號通路減輕大鼠原代神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷；本研究基于AMPK/mTOR/ULK1自噬信號通路，探討補(bǔ)陽還五湯抗大鼠腦IR損傷的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物48只SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250-280) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(京)2016-0006)，飼養(yǎng)時溫度、濕度適宜，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑、儀器補(bǔ)陽還五湯內(nèi)含黃芪120 g，赤芍5 g，當(dāng)歸6 g，紅花、桃仁、川芎、地龍各3 g，水煎劑濃縮至100 mL，濃度1.43 mg·L-1(藥材購自河北樂仁堂藥業(yè)有限公司)；AMPK激動劑Metformin(HY-17471A)購自MCE公司；抗體AMPKa(#2532)、mTOR(#2972)、p-AMPKa(#2535)、p-mTOR(#5536)、p-ULK1(#14202)均購自CST；ULK1抗體(SAB2109080-100uL)、LC3B抗體(L7543-100 uL)均購自Sigma；β-actin抗體(GB11001)、二抗(GB23303)購自賽維爾；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(購自Beyotime)；PVDF膜(孔徑0.45 μm和0.2 μm)購自美國Millipore公司；TUNEL試劑盒購自promega。多功能成像系統(tǒng)(Fusion FX5 Spectra)購自法國Vilber公司；leica顯微鏡拍照系統(tǒng)、正置熒光顯微鏡(DM5000B)均購自德國Leica公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方案將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、腦缺血/再灌注模型組(Model)、補(bǔ)陽還五湯組(BYHWD)、補(bǔ)陽還五湯+AMPK激動劑Metformin組(BYHWD+Met)。BYHWD和BYHWD+Met組大鼠術(shù)后24 h內(nèi)予以補(bǔ)陽還五湯14.3 g·kg-1灌胃，BYHWD+Met組大鼠于線栓插入后即刻予Metformin 10 mg·kg-1腹腔注射，Sham和Model組大鼠予以等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)應(yīng)用3 d，神經(jīng)功能評分完成后處死大鼠取材。

2.2 大鼠腦缺血/再灌注模型制作方法采用改良的線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)模型。應(yīng)用1%戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行腹腔注射(用量50 mg·kg-1)，將麻醉后的大鼠采用仰臥位固定于手術(shù)操作臺上。對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，于大鼠頸部正中偏左側(cè)行縱向切口，逐層對暴露的組織和血管進(jìn)行鈍性分離，并將兩側(cè)的組織利用拉鉤進(jìn)行固定擴(kuò)大手術(shù)視野，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈。動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，于頸外動脈遠(yuǎn)心端剪一“V”型切口，經(jīng)此斜口插入線栓沿頸內(nèi)動脈到達(dá)大腦前動脈起始端，入栓長度19 mm左右遇阻力則停止。2 h后拔出線栓，再灌注72 h后處死大鼠取材。Sham組僅分離血管，不插線栓。

2.3 神經(jīng)功能缺失體征評分缺血/再灌注d 3參照Zea longa評分法對各組大鼠的神經(jīng)功能缺失情況進(jìn)行盲評。具體標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：無自主活動或陷入深度昏迷中。得分越高表明神經(jīng)功能損傷越重。

2.4 TTC染色檢測大鼠腦梗死體積再灌注72 h后，麻醉大鼠進(jìn)行取腦，將其置于腦槽內(nèi)并于-20 ℃中凍存15 min，取出后行2 mm厚度的冠狀面切片，將各切片移至培養(yǎng)皿中加入TTC染液，放置在37 ℃恒溫箱中避光孵育20 min，每10 min翻動1次。完成染色后，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃過夜后拍照。用Image Pro Plus 6.01圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測大鼠腦梗死體積。

2.5 尼氏染色法觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量將大鼠灌流取腦后制備石蠟切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟(分別二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min)，乙醇脫水(濃度梯度分別100%、95%、90%、80%、70%各5 min)；蒸餾水沖洗3次，每次5 min；用甲苯胺藍(lán)染液浸染組織，后用蒸餾水洗凈染料，再依次置于70%、80%、95%和100%乙醇中脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察拍照，觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

2.6 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡將大鼠灌流取腦后制備冰凍切片，冰凍切片置于4%多聚甲醛固定30 min，于PBS(pH 7.4)中清洗5 min，共3次；應(yīng)用蛋白酶K工作液(原液 ∶PBS=1 ∶9)修復(fù)22 min，洗滌、破膜，加入buffer常溫孵育10 min；按照TUNEL試劑盒說明配置反應(yīng)液覆蓋組織，37 ℃恒溫孵育2 h，后續(xù)進(jìn)行DAPI復(fù)染細(xì)胞核、封片，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察并拍照，觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)取適量大鼠腦組織加入RIPA蛋白裂解液，經(jīng)過研磨、離心、取上清、蛋白變性等步驟制備蛋白樣。制備SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳分離，用濕法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%BSA進(jìn)行膜封閉2 h，孵育一抗并置于4 ℃過夜。次日洗膜，二抗孵育1 h，再次洗膜，最后顯影成像，Image Lab軟件(Bio-Rad)對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能評分的影響Fig 1所示，Sham組大鼠無神經(jīng)功能損傷，結(jié)果為0分。Model組較Sham組評分增加(P<0.05)；BYHWD組較Sham組評分下降(P<0.05)，BYHWD+Met組則評分較BYHWD組增加(P<0.05)。

3.2 補(bǔ)陽還五湯對腦梗死體積的影響Fig 2A所示為腦梗死情況，左側(cè)大腦缺血明顯則可見白色梗死區(qū)，無損傷則大腦為鮮紅色。Sham組未見梗死區(qū)，對比Sham組，Model組、BYHWD組和BYHWD+Met組左側(cè)大腦缺血明顯，可見白色梗死區(qū)。如Fig 2B所示，與Model組相比，BYHWD組大鼠腦梗死體積比率明顯下降，差異具有顯著性(P<0.05)。AMPK激動劑則減弱了補(bǔ)陽還五湯的作用，腦梗死體積有所上升(P<0.05)。

Fig 1 Neurological function score of n=12)

3.3 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響Fig 3所示，Sham組大鼠皮層細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，胞質(zhì)、核仁清晰，有大量的神經(jīng)細(xì)胞存在；與Sham組相比，Model組皮層中細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞排列紊亂，輪廓模糊不清；與Model組比較，BYHWD組皮層中細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞邊界較清晰，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較Model組有增加(P<0.05)；AMPK激動劑削弱補(bǔ)陽還五湯對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用(P<0.05)。

3.4 補(bǔ)陽還五湯對大鼠細(xì)胞凋亡情況影響Fig 4所示，對比Sham組，Model組大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，與Model組相比，BYHWD組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；增加AMPK激動劑處理后，補(bǔ)陽還五湯的作用受到拮抗，細(xì)胞凋亡率有所增加(P<0.05)。

3.5 補(bǔ)陽還五湯對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5A展示了補(bǔ)陽還五湯對自噬蛋白LC3表達(dá)的影響。與Sham組相比較，Model組大鼠缺血側(cè)腦組織的LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P<0.05)；與Model組比，BYHWD組LC3Ⅱ/Ⅰ有所下降(P<0.05)。如Fig 5B所示，與Sham組相比，Model組p-AMPK/AMPK比值明顯升高(P<0.05)，與Model組比較，BYHWD組p-AMPK/AMPK比值下降(P<0.05)。Fig 5C、D所示與Sham組比較，Model組p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值降低；與Model組相比，BYHWD組p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值明顯升高(P<0.05)；在AMPK激動劑的作用下，使補(bǔ)陽還五湯對上述各項(xiàng)指標(biāo)的影響下降，并均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 Infarct volume of rats n=4)

Fig 3 Nissl staining of rats (×400) n=4)

Fig 4 Neuron apoptosis of rats (×200) n=4)

4 討論

缺血性腦卒中病理機(jī)制復(fù)雜，針對發(fā)病機(jī)制的各種神經(jīng)保護(hù)治療效果不夠理想[8]，有效的溶栓治療受到嚴(yán)格的時間窗限制，探尋中醫(yī)藥的治療可能是一有效手段。補(bǔ)陽還五湯用于腦卒中治療歷史久遠(yuǎn)，可發(fā)揮補(bǔ)氣活血，化瘀通絡(luò)之功，多項(xiàng)基礎(chǔ)和臨床研究表明補(bǔ)陽還五湯具備抗腦IR損傷的作用[9-10]。我實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明補(bǔ)陽還五湯可上調(diào)Notch1、Hes1、Hes5的表達(dá)，對腦IR損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后的腦保護(hù)功能起到促進(jìn)作用[11]。趙欣等[5]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可通過調(diào)節(jié)自噬、穩(wěn)定線粒體功能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的“清道夫”，可對內(nèi)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)視，及時清除老化的細(xì)胞器、損傷蛋白質(zhì)，腦缺血發(fā)生后自噬呈上調(diào)趨勢[12]。自噬早期可起到保護(hù)性作用，24 h應(yīng)用自噬抑制劑3-MA進(jìn)行干預(yù)會增加神經(jīng)元死亡率；但是48和72 h后自噬抑制劑的介入可顯著保護(hù)神經(jīng)元免于死亡[13]。通過側(cè)腦室注射3-MA可顯著抑制模型組LC3Ⅱ的升高，抑制缺血半暗帶神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡，縮小腦缺血損傷病變范圍[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)葛根素通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路抑制自噬，保護(hù)腦IR損傷大鼠神經(jīng)功能。

當(dāng)細(xì)胞能量充足時，AMPK處于失活狀態(tài)，mTOR處于活化狀態(tài)，活化的mTOR對ULK1的Ser757位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，并防止ULK1的其他位點(diǎn)被AMPK直接激活，自噬受到抑制。在腦IR損傷能量迅速消耗甚至衰竭的情況下，AMPK催化亞基位點(diǎn)Thr172磷酸化激活，抑制mTOR，使ULK1位點(diǎn)Ser757磷酸化受到抑制；并且AMPK直接對ULK1其他位點(diǎn)磷酸化活化，最終解除mTOR的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮AMPK的促進(jìn)作用，啟動自噬[16]。

本研究對補(bǔ)陽還五湯介導(dǎo)AMPK/mTOR/ULK1自噬信號通路抗大鼠腦IR損傷機(jī)制進(jìn)行探討。通過建立大鼠MCAO模型，選擇再灌注72 h進(jìn)行觀察。在自噬過程中，LC3的羧基末端脂質(zhì)修飾即LC3Ⅱ的增加是自噬體形成所需的特征性表現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)陽還五湯抑制了LC3Ⅱ的表達(dá)，同時AMPK的磷酸化水平降低，活化的mTOR和ULK1 Ser757磷酸化增加，而AMPK激動劑則逆轉(zhuǎn)了補(bǔ)陽還五湯的上述作用，表明補(bǔ)陽還五湯通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路抑制自噬，使大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降，缺血側(cè)腦組織病理損傷程度減輕，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)性作用。