白楊素通過SIRT1/AMPK信號通路緩解乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝損傷

周禹檸，徐培杰，鄧楚凡，王璐瑩，陶夢停，楊 勇，白 婷

(大連大學(xué) 慢性病研究中心大連市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長期飲酒引起的肝臟損害，是進(jìn)展期肝臟疾病非常重要的原因之一。ALD疾病譜酒精性脂肪肝的發(fā)病率也逐漸增高，若得不到有效治療可導(dǎo)致酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、肝硬化，對患者身體健康有著嚴(yán)重影響[1]。因此，探明ALD的發(fā)病機(jī)制，以期為探索有效的ALD治療靶點(diǎn)提供堅實(shí)的理論依據(jù)尤為重要。白楊素(chrysin，CHR)是廣泛存在于蜂蜜、蔬菜、水果中的天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌的活性[2]。該研究采用小鼠Lieber-DeCarli酒精液體飼料聯(lián)合單劑酒精灌胃模型，探討白楊素對酒精性肝損傷中SIRT1/AMPK信號通路的調(diào)控作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，SCXK(遼)2020-0001。

1.2 藥物與試劑白楊素(HY-14589)、SRT1720(SIRT1激動劑，HY-15145)、AICAR(AMPK激動劑，HY-13417)均購買于MCE上海皓元生物公司；Lieber-DeCarli酒精液體飼料(南通特洛菲公司)；甘油三酯(TG)試劑盒(A110-1-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(C010-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(C009-2-1)均購買于南京建成生物工程研究所；AMPKα抗體(cs-5831)、p-AMPKα抗體(cs-2535)、SIRT1抗體(cs-2028)、GAPDH抗體(cs-2118)均購買于CST公司。

2 方法

2.1 動物分組48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成6組：正常組、酒精模型組(EtOH)、SRT1720組(EtOH+SRT1720)、AICAR組(EtOH+AICAR)、CHR組(EtOH+CHR 25、50 mg·kg-1)，每組8只。

2.2 造模及給藥采用Gao-Binge模型方法建立小鼠酒精性肝病模型[3]，應(yīng)用Lieber-DeCarli的對照飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，除正常組外，其余5組給予含5%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)。每天1次對CHR組進(jìn)行不同濃度的CHR灌胃，SRT1720組50 mg·kg-1SRT1720灌胃，AICAR組500 mg·kg-1AICAR灌胃，持續(xù)喂養(yǎng)10 d。d 11對照組灌胃麥芽糖糊精，其余5組給予5 g·kg-1酒精灌胃，9 h后采用乙醚麻醉小鼠，眼球采血，取出肝臟左前葉用多聚甲醛固定，其余置-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清生化指標(biāo)測定使用檢測試劑盒測定AST、ALT、TG血清中含量。

2.4 肝組織病理及免疫組織化學(xué)檢測肝組織病理切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色及SIRT1、p-AMPKα免疫組化染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

2.5 肝臟中蛋白表達(dá)檢測取肝組織勻漿提取蛋白，采用Western blot檢測SIRT1、AMPKα、p-AMPKα的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 CHR對小鼠血清中AST、ALT、TG含量的影響如Tab 1結(jié)果顯示，與正常組相比，EtOH組小鼠血清中AST、ALT、TG含量明顯升高(P<0.01)，與EtOH組相比，CHR給藥組呈劑量依賴性降低，SRT1720、AICAR組3者水平均明顯降低(P<0.01)，且CHR高劑量組要低于各激動劑組。

Tab 1 Comparison of serum AST, ALT, TG content in each group n=8)

3.2 CHR對小鼠肝組織病理變化的影響HE染色結(jié)果顯示，EtOH組肝細(xì)胞腫脹，有脂肪空泡、炎性細(xì)胞浸潤等病理損傷，CHR給藥組隨著濃度增加，肝組織病理變化明顯減弱，SRT1720、AICAR組小鼠肝組織病理變化明顯減輕。

3.3 CHR對小鼠肝臟SIRT1、AMPKα、P-AMPKα表達(dá)的影響免疫組化染色結(jié)果顯示，正常組SIRT1、P-AMPKα細(xì)胞染色有大量黃色或棕黃色，EtOH模型組小鼠肝臟SIRT1、P-AMPKα表達(dá)明顯減少。與EtOH組相比，CHR給藥組、SRT1720及AICAR組的SIRT1、P-AMPKα表達(dá)明顯增加。同時，采用Western blot檢測SIRT1、AMPKα、P-AMPKα蛋白表達(dá)水平，與正常組比較，EtOH組SIRT1、AMPKα表達(dá)水平以及AMPKα的磷酸化水平明顯減少(P<0.01)，與EtOH組比較，CHR給藥組以及SRT1720、AICAR組SIRT1、AMPKα表達(dá)水平以及AMPKα的磷酸化顯著增加，且有一定的劑量依賴性(P<0.01)。

4 討論

Gao-Binge模型模擬了慢性加急性酒精性肝損傷的患者病程，這種慢加急性協(xié)同作用導(dǎo)致小鼠脂肪變性、炎癥和肝損傷[4-5]。本研究顯示，小鼠酒精模型組的肝臟甘油三酯蓄積，脂肪空泡形成，炎性細(xì)胞浸潤，表明成功建立Gao-Binge酒精性肝病模型，且CHR給藥組的小鼠肝臟脂肪變性減輕，血清中轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)AST、ALT及TG含量明顯降低，表明CHR能夠改善酒精性肝損傷。

SIRT1/AMPK信號通路在酒精性肝損傷中起關(guān)鍵作用[6]，本研究發(fā)現(xiàn)CHR能夠增強(qiáng)SIRT1、AMPKα表達(dá)水平及AMPKα的磷酸化作用。綜上所述，白楊素能夠改善酒精性肝損傷進(jìn)程，激活SIRT1/AMPK信號通路是其可能的分子機(jī)制。