小柴胡湯治療骨性關節炎的網絡藥理學研究

吳立蔚，許楊，李晶，陳君春，梁嘉敏，劉倩,，楊淵

(1.廣西醫科大學，廣西再生醫學重點實驗室，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西再生醫學研究中心，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學附屬埌東醫院，廣西 南寧 530021)

0 引言

骨性關節炎(Osteoarthritis, OA)，屬中醫“痹癥”“骨痹”范疇，多因肝腎虧虛，氣血虛弱，寒濕痹阻經絡所致，是最常見的關節炎形式，在65歲以上的人群中，三分之一的人受到影響，女性比男性受到的影響更大[1]，目前對骨性關節炎患者進行治療的時候，使用中醫骨科康復治療無論是在治療效果、關節修復方面都具有明顯的優勢，有效緩解患者的疼痛感、提高他們的生活質量[2]。小柴胡湯出自東漢張仲景的《傷寒論》，是中醫和解少陽的經典方劑，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草(炙)、生姜(切)、大棗(擘)組成，根據相關研究報道其具有抗炎、抗肝纖維化、抗腫瘤及調節內分泌等作用[3]，臨床上主要運用于內科方面的治療[4]，但尚無小柴胡湯在治療骨性關節炎方面的研究。本研究通過網絡藥理學研究方法，研究小柴胡湯中治療骨性關節炎的潛在分子機制，為了尋求更好的治療骨性關節炎的新途徑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 小柴胡湯主要活性成分及其作用靶點的篩選

通 過TCMSP數 據 庫(https：//tcmspw.com/index.php)檢索小柴胡湯中柴胡、黃芩、半夏、人參、甘草、生姜、大棗有效活性成分[5]，獲取對應的靶點。設定口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB)和類藥性(Drug-likeness, DL)為基礎篩選條件，選擇OB值大于等于30%、DL值大于等于0.18為篩選參數，最后將獲得的蛋白質靶點在DrugBank數據庫(https：//go.drugbank.com/)和Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)進行檢索并加以規范化，刪除重復或無效數據[6,7]。

1.2 骨性關節炎相關致病靶點的篩選

運 用GeneCard數 據 庫(https：//www.genecards.org/)檢索“osteoarthritis”[8]，獲得疾病相關靶點，并在Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)進行庫檢索刪除重復或無效數據。結合篩選出的藥物相關基因靶點利用在線作圖工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，得到骨性關節炎-小柴胡湯的交集可視化韋恩圖。

1.3 小柴胡湯治療骨性關節炎的網絡調控構建

將方劑各組分相關信息和交集基因靶點數據導入Cytoscape3.8.2作圖分析軟件，進行網絡可視化分析，建立方劑-基因靶點的網絡調控圖，其中設置有效藥物活性成分節點連接的潛在靶點數量與節點大小成正比，從中挑選突出的關鍵節點，對應小柴胡湯治療骨性關節炎過程中的關鍵有效藥物活性成分。

1.4 蛋白質互作用網絡的構建與核心靶點篩選

將獲得的藥物作用靶點和疾病靶點數據導入Cytoscape3.8.2，使用Bisogenet插件構建藥物靶點蛋白質與疾病靶點蛋白質相互作用網絡(Protein-Protein Interaction, PPI)，提取交集得出交集PPI網絡，使用插件CytoNCA對交集PPI網絡數據進行拓撲屬性分析，對各個節點在全網絡中的關鍵性進行評估篩選出核心靶點網絡。

1.5 蛋白質互作用網絡關鍵模塊的提取

使用Cytoscape3.8.2中MCODE插件對關鍵靶點網絡進行分析，提取其中關鍵蛋白模塊，并使用String數據庫(https：//www.string-db.org/)分析作圖，利用Metascape對其進行分子功能分析，以此得出可能作用的信號通路[9]。

1.6 核心靶點的生物富集和通路分析

將核心靶點基因上傳DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)[10]，進行GO生物富集和KEGG通路分析，下載分析結果用R軟件輸入相應代碼進行可視化分析。

2 結果

2.1 小柴胡湯的作用靶點

通過TCMSP數據庫分別對小柴胡湯的7個成分進行查詢，根據數據庫參數信息設置OB≥30%和DL≥0.18為基礎條件，篩選得到193個有效成分，290個對應蛋白靶點，同時將所得靶點分別導入DrugBank和Uniprot數據庫里進行檢索，刪除重復以及無效靶點最終得到靶點265個。

2.2 小柴胡湯相關靶點

在Genecard數據庫中輸入“骨性關節炎”搜索到相關基因5244個，導出后通過Uniprot和DrugBank數據庫檢索去除無效靶點，最終得到疾病基因1304個。最后利用在線作圖軟件(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取疾病基因與藥物靶點基因的交際圖，見圖1，獲得交集基因133個。

圖1 小柴胡湯活性成分靶點與骨性關節炎靶點韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病靶點網絡

通過Cytoscape3.8.2軟件構建藥物成分-活性成分-基因靶點網絡，其中基因以及黃芩對應的活性成分根據Degree值的中位數進行第一次篩選，然后再將甘草對應的活性成分根據Degree值的二倍中位數進行第二次篩選，得出圖2，最終獲得174個節點，661條連接。并將基因靶點按照Degree排序得出其編號前十對應的藥物成分分別是有槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、甘草鹵酮、脛骨青霉素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素，提示可能在小柴胡湯治療骨性關節炎時發揮重要作用。

圖2 藥物成分-活性成分成分-基因靶點網絡

表1 小柴胡湯可能發揮作用藥物成分

2.4 小柴胡湯治療骨性關節炎的PPI網絡和核心靶點的篩選

運行BisoGenet插件構建小柴胡湯-骨性關節炎交集基因靶點PPI網絡，最終得出節點5653個，蛋白質相互關系137483條。按二倍中位數的中介中心性(Betweenness Centrality, BC)值，接近中心性(Closeness Centrality, CC)值，二倍中位數的Degree值，進行第一次篩選，然后再按二倍中位數的Degree值，中介中心性，接近中心性的二倍中位數進行第二次篩選，得到核心靶點網絡，節點31個，蛋白質互相關系260條，見圖3。得到前5名核心靶點有FN1(纖連蛋白1)、APP(淀粉樣前體蛋白)、CDK2(細胞周期蛋白依賴性激酶 2)、EP300(E1A 結合蛋白P300)和EWSR1(內皮細胞性骨髓肉瘤斷裂點區1)等。

圖3 小柴胡湯治療骨性關節炎蛋白質互作用網絡以及核心靶點圖

2.5 對小柴胡湯治療骨性關節炎核心網絡的關鍵模塊的提取

使用Cytoscape3.8.2軟件中MCODE(Molecular Complex Detection)插件對核心靶點網絡進行分析，提取出3個評分最高的蛋白質聚集模塊，并通過Metascape在線分析網站對其進行GO分子功能分析，分析其模塊可能參與的作用通路，去除無效連接，見圖4。

圖4 小柴胡湯治療骨性關節炎核心網絡關鍵模塊圖及分子功能分析圖

2.6 核心靶點的生物富集分析及可視化

使用DAVID數據庫，對核心靶點31個基因進行生物富集分析。分析核心靶點的細胞組分(Cellular Component, CC)，分子功能(Molecular Funtion, MF)，生物過程(Biological Process, BP)，并按Count值和Pvalue將結果排序即富集在該項上的靶點與核心靶點總數的比值，將排名前10的各項R軟件繪制氣泡圖，細胞組分有：受體復合物，蛋白復合物，核，核質，細胞質等，生物過程：正調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄，細胞熱反應調節，ERRB2信號通路等，分子功能：轉錄因子結合，蛋白結合，ATP結合，結合泛素連接酶等，見圖5。同時分析KEGG通路富集分析，按Count值和P值排序，將排名前10條通路用R軟件繪制氣泡圖，結果有Wnt signaling pathway；磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3KAKT signaling pathway)；絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)；Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活因子信號 通 路(JAK-STAT signaling pathway)；FoxO信 號 通 路，見圖6。

圖5 生物富集分析氣泡圖以及KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

針對OA的治療手段從現代醫學角度來看，主要的治療方法有從自體軟骨細胞植入、再生等，但是效果并不顯著[11]。反觀之自古以來中醫學對骨性關節炎的研究就從未停止，其將外邪的致病性及內因同時納入考慮范圍，臨床上運用中藥方劑治療不僅改善了臨床癥狀，而且兼顧了疾病內在的因果，療效確切[12]，但美中不足的是傳統中醫學對治療OA的分子機制仍不明確。本研究通過充分利用全新的網絡藥理學的技術與理念，探究小柴胡湯在OA治療中的核心作用靶點、信號通路和生物進程。

我們首先針對小柴胡湯的各組分利用網絡藥理學的研究方法進行藥物-成分-疾病靶點網絡分析篩選出槲皮素，山奈酚，漢黃芩素，甘草鹵酮，脛骨青霉素，7-甲氧基-2-甲基異黃酮，美迪紫檀素七種有效化學成分，其中槲皮素，山奈酚均為黃酮類化合物有抗炎、抗菌等作用[13,14]，美迪紫檀素具有骨保護、抗菌、抗腫瘤等活性作用[15]，以上成分均提示存在治療OA的潛在作用。同時篩選出來的核心靶標主要有FN1、APP、CDK2、EP300和EWSR1等，這些基因靶點通過細胞組分、生物過程、分子功能主要影響受體復合物，蛋白復合物，核，正調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄，細胞熱反應調節，轉錄因子結合，蛋白結合，結合泛素連接酶等生物過程，FN1廣泛參與細胞遷移、黏附、增殖、止血及組織修復等過程，有研究表明可激活TGF-β/PI3K/AKT促進軟骨細胞分化和膠原合成[16]，從而可能影響OA的進程；在2020年E. Ristori, S. Donnini, M. Ziche等人研究發現APP的完整表達和加工是正常內皮功能所必需的[17]，CDK2則有可能參與OA的發病機制[18]，EP300和EWSR1分別通過自噬蛋白結合以促進軟骨的形成以及遺傳和表觀學途徑來對抗細胞衰老[19,20]，通過KEGG分析得出可通過Wnt，PI3K-AKT，FoxO，MAPK以及JAK-STAT信號通路進而干預OA的發生發展，Wnt信號的上調導致分解代謝酶增加、成骨細胞分化和炎癥從而引起OA[21]，PI3K-AKT信號通路通過PIP3激活AKT，AKT的磷酸化可通過下游多個靶點調控軟骨細胞自噬和其線粒體的融合及裂變影響OA的進程[22,23]。而且FoxO轉錄因子對于軟骨發育、成熟、體內平衡從而影響整個骨關節炎發病機制[24]。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)和Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)可通過影響軟骨細胞增殖、分化、凋亡、炎癥以此調節軟骨細胞的有害炎癥刺激的表達[25,26]。

綜上所述，利用網絡藥理學方法研究小柴胡湯作用于OA的主要機制，我們發現小柴胡湯作用于FN1、APP、CDK2、EP300和EWSR1等關鍵靶點，通過Wnt，PI3K-AKT，MAPK以及JAK-STAT信號通路等重要通路，發揮抗炎和抗凋亡等功能而實現對OA發病機制的干預作用，為小柴胡湯抗骨性關節炎的科學研究及應用提供理論基礎。