頸項透明層增厚胎兒的超聲及產前診斷結果分析

杜秀鳳，史淑瓊，陳淑芬，鐘進，宋春林，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院產前診斷中心，廣東 佛山 528000)

0 引言

頸部透明層厚度(nuchal translucency，NT)，是指孕 11 ～ 13+6周胎兒頸后皮膚的厚度，由頸后部皮下組織內液體積聚形成的無回聲帶，一般情況下NT會隨孕周的增加而上升，孕14周后胎兒淋巴系統發育完全，胎兒頸項部積聚的液體迅速引流而不再進展。孕早期胎兒頸項透明層增厚是指大于頭臀徑相對應的NT值正常范圍的第95百分位數。NT 增厚與染色體異常的發生呈正相關，還與微缺失/微重復綜合征、胎兒心臟或骨骼畸形、重型地中海貧血、努南綜合征等的發病有關[1-3]。本研究通過分析 NT 增厚胎兒的超聲及介入性產前診斷結果，在傳統的染色體核型分析基礎上同時檢測高通量測序染色體拷貝數變異(CNV-seq)，對 NT 增厚胎兒的遺傳學特點進行分析，為無創產前檢測技術(NIPT)及CNV-seq在孕婦胎兒染色體非整倍體篩查中的應用提供數據支持，總結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月至2020年7月在佛山市婦幼保健院進行早孕期胎兒超聲檢查，結果顯示NT增厚的361例單胎妊娠胎兒為研究對象。其胎兒超聲檢查結果顯示，胎兒頭臀徑長(CRL)為45～84mm，NT值為2.5～12.9mm，孕婦年齡19～45歲。納入標準：①單胎；②胎兒超聲檢查孕周滿足11～13+6周；③胎兒NT值＞第95百分位或≥3.0mm，45mm≤CRL≤84mm；④其他：排除了自身惡性腫瘤、染色體異常、干細胞移植手術等。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

在孕11～13+6周進行，選擇腹部超聲檢查，胎兒自然姿勢取正中矢狀面，盡可能將圖像放大，使圖像只顯示胎兒頭部及上胸，胎兒頸部皮膚與軟組織間半透明組織間的最大厚度值重復測量3次，取最大數值。

1.2.2 高通量基因測序的無創產前檢測技術

抽取孕婦外周血10mL，于48h內進行血漿分離并純化，提取樣本的血漿DNA。將帶有序列標簽的接頭引物用于構建血漿DNA文庫。利用illumina NextSeq CN500平臺進行大規模并行基因組測序。應用生物信息工具放大并分析外周血中不同染色體水平的差異，將每個樣本測序的序列與人類參考基因組進行比對，最終得出胎兒患染色體非整倍性風險。

1.2.3 染色體核型分析

對NIPT高風險及NT異常的孕婦進行遺傳咨詢，知情同意后進行絨毛膜穿刺(11～13+6)或羊水穿刺(17～24周)，取得的標本進行細胞培養、收獲、制片并經G顯帶染色，在光學顯微鏡下分析染色體核型。

1.2.4 染色體拷貝數變異檢測(CNV-seq)從羊水中提取微量(50～100ng)

基因組DNA，通過超聲法將大片段DNA打碎，通過末端標記、接頭連接和PCR擴增進行DNA文庫的構建。使用美國illumina公司NextSeq CN500測序儀器平臺，對樣品DNA 進行大規模平行測序，測序結果通過生物信息分析，與公共數據庫(OMIM、DGV、DECIPHER、UCSC和Pubmed)進行比對，將染色體拷貝數變異分為五類：致病、可能致病、良性、可能良性和臨床意義不明(VOUS)。

2 結果

2.1 一般情況

胎兒NT值為2.5～14.8mm，單純性NT增厚胎兒262例(72.6%)，伴其他超聲異常胎兒99例(27.4%)，其中單純NT增厚胎兒有35例無創NIPT高風險。所有孕婦平均年齡31.72歲(19～45歲)，其中高齡103例(28.5%)。所有病例均行介入性產前診斷，12例絨毛取樣、349例羊膜腔穿刺術，361例均同時行染色體核型分析及CNV-seq檢測，共檢出異常核型71例(19.7%)，正常核型290例(80.3%)。

2.2 NT增厚胎兒無創基因檢測(NIPT)結果分析

35例NIPT高風險中，31例21三體高風險，4例18三體高風險，后經絨毛活檢及羊膜腔穿刺分析胎兒染色體核型與NIPT結果一致。

2.3 NT增厚胎兒染色體核型結果分析

71例異常核型中非整倍體67例(94.4%)、結構異常3例(4.2%)、嵌合體1例(1.4%)；21三體綜合征共44例、18三體綜合征共13例、13三體綜合征共1例、性染色體三體9例包 括1例47,XXX、1例47,XYY、2例47,XXY、5例45,X；染色體結構異常3例：分別是46,XN,del(8)(q24.1)；46,XN,der(2)t(2；4)(q37.3：p15.2)pat；47,XN,+i(12)(p10)；嵌 合 體1例：47,XN,+3[33]/47,XN,+18[67]，表1。

表1 361例NT 增厚胎兒染色體核型結果分析

2.4 NT增厚胎兒CNV-seq結果分析

361例 胎 兒 中，112 例(31.0%)檢 出 CNVs，其 中 致 病性 CNVs79例(21.9%)，VOUS 21例(5.8%)，良 性 CNVs 12例(3.3%)。致病性CNVs79例，其中71例與前文染色體核型異常結果一致，CNV-seq在 290例核型正常胎兒中額外檢出8例(2.8%)致病性 CNVs 及 21例(7.2%)VOUS，表2。

表2 正常染色體核型胎兒中8例致病性 CNVs結果

3 討論

3.1 英國學者在90年代初在超聲檢查中發現早孕期胎兒頸部皮下均存在無回聲帶特征，并使用頸部透明層來描述這一現象，后更多學者發現早孕期頸后皮下積水有不同表現，有無分隔及多分隔水囊瘤，在孕14周后可逐漸消退或形成頸部皮膚皺褶。NT增厚的病因與頸淋巴囊匯入淋巴系統失敗有關，淋巴液受阻后積聚在頸部，頸后皮膚就會增厚。淋巴回流障礙僅是NT增厚的病理原因之一，透明基質增加和膠原纖維網發育紊亂使唐氏綜合征胎兒頸部發生海綿樣改變而液體積聚，心力衰竭時靜脈回流障礙、骨骼發育不良使胸腔縮窄、胎兒非免疫性水腫等都可以導致NT增厚。NT增厚的眾多原因中，胎兒染色體異常是最重要的，特別是21三體綜合征，此外三倍體、18三體綜合征、13三體綜合征及性染色體非整倍體等胎兒也會出現增厚[4]。黃冬冰[5]對382例NT≥3 mm孕婦進行研究結果顯示NT 增厚胎兒染色體核型異常檢出率為 22.4%，以 21- 三體為主(54.1%)；黃婷婷[6]對208 例 NT≥2.5 mm孕婦行介入性產前診斷，致病性染色體異常檢出率為 23.56%，主要為 21-三體綜合征；王宏[7]研究549例NT≥3.0mm孕婦的產前診斷結果認為 T21、T18、T13、Turner綜合征的 NT均值分別為4.0mm、5.1mm、6.3mm、6.5mm，染色體異常的概率與NT增厚成正比。本研究發現NT增厚胎兒的致病性染色體異常以非整倍體為主，發生率94.4%(67/71)，NT增厚的判斷臨界值是2.5mm還是3.0mm，目前國內學者還沒有共識，尚需進一步研究。

3.2 無創產前檢測技術(Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT)

提取孕婦外周血中胎兒游離 DNA，檢測胎兒是否患 21三體、18三體、13 三體綜合征，與傳統的血清學篩查相比較有著更高的準確率及更低的假陽性率，且已在臨床應用中取得顯著成效，避免了一部分不必要的有創性穿刺風險如流產、感染、羊水滲漏等。Liang[8]等的研究發現基因組的表達與GC含量呈線形關系，通過大規模平行測序技術NIPT對24種染色體非整倍體的檢測都是可行的，針對T21、T18、T13、T9和性染色體非整倍體的靈敏度為100%，特異度為99.71%。史淑瓊[9]等研究認為NIPT在臨床工作中可以提高篩查能力，減少不必要的有創性產前診斷操作。翟敬芳[10]研究認為NT異常聯合NIPT對胎兒非整倍體陽性預測率為20.51%，單胎妊娠高齡孕婦胎兒染色體非整倍體異常可采用兩者聯合篩查方式。我們產前診斷中心的研究經驗一般以孕早期NT超聲為首要檢查項目，NIPT可做為補充檢查項目，兩者聯合可大大提高臨床對染色體疾病的檢出能力及減少漏診。

3.3 CNV-seq對標本基因組進行測序

測序結果通過生物信息學分析，與人類參考基因組進行比對，可發現受檢標本全部的23對染色體非整倍體及染色體變異大于100KB的微缺失/微重復。Liang[11]對72例樣本進行回顧性臨床研究，認為CNV-seq和微陣列比較基因組雜交技術對于目前已知致病拷貝數變異都能達到相同的檢測率，但CNV-seq在某些致病性未知的CNVs檢測上更能發現新的染色體疾病，具有良好的特異性及可重復性。Zhu[12]聯合運用CNV-seq與SNPArray技術對115例產前超聲結構異常的羊水標本進行檢測，認為CNV-seq可以替代SNPArray用于產前超聲結構異常的胎兒染色體檢測中。Liu[13]等比較了傳統核型分析與CNV-seq在檢測與自發流產相關的染色體異常方面的效能，研究結果表明，CNV-Seq與核型分析相比具有檢測時間短、可檢測嵌合體以及檢測所需樣本量低等優勢。本研究共發現致病性CNVs79例，其中71例與傳統染色體核型異常結果一致，CNV-seq在290例核型正常胎兒中額外檢出8例(2.8%)致病性CNVs及21例(7.2%)VOUS。

NT不僅可以確定孕齡，也是篩查早孕期胎兒染色體異常的有效指標，對于NT增厚胎兒建議有資質的醫生進行遺傳咨詢，可選擇染色體核型分析及高通量測序技術的染色體拷貝數變異檢測(CNV-seq)，并充分告知各種檢測的覆蓋范圍及局限性，并需要在孕中期進行系統結構及胎兒心臟超聲篩查，這對降低先天缺陷兒的出生，優生優育及提高人口素質有重要意義。