健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、 銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌殺菌效果的研究

劉菁，丁淑琴，張瑋，張怡清，賀嘉夫茹孜

(寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004)

0 引言

近年來，高校實驗室安全事故頻繁發生，不僅威脅師生的生命安全，也給社會帶來了一定的負面影響。實驗室安全包括水、電、危險化學品、消防、生物安全等方面，尤其是生物安全，一旦出現菌種泄露，帶來的危害將無法預估。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌作為實驗室常用的實驗教學菌種，如果選擇不合適的消毒劑，其消毒效果不能完全殺滅細菌，菌種會被學生帶出實驗室，造成菌種泄露，危害師生生命安全。此外，消毒劑質量的良莠不齊也將導致消毒效果不能達到如期效果。

健之素是中華預防醫學會推薦使用的廣譜高效消毒劑[1]，其對不同的菌種消毒效果均不相同，而且其濃度隨著配置時間的延長逐漸降低。因此，研究了健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌五種不同菌種的殺菌結果，觀察健之素的消毒效果，為防止菌種泄露，保障實驗室的生物安全提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

健之素(北京長江脈醫藥科技有限責任公司，產品批號201022W，有效含量250±25mg/每片)；硫代硫酸鈉；pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)；有機干擾物為3%的牛血清白蛋白；營養肉湯；營養瓊脂；哥倫比亞血瓊脂；生理鹽水；胰蛋白胨。

1.2 菌種和菌懸液的制備

大腸埃希菌菌(44155)、銅綠假單胞菌(10102)、肺炎克雷伯桿菌(46117)、陰溝腸桿菌(ATCC700323)和鮑曼不動桿菌(ATCC19606)由本實驗室保存。常規復蘇細菌，并經正常傳代2～3次后使用。將細菌接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，37℃培養至對數生長期，從瓊脂哥倫比亞血平板中挑選幾個菌落直接在無菌生理鹽水中制成菌懸液，校準菌懸液濁度為0.5麥氏單位(含1×108CFU/mL)。

1.3 中和劑鑒定試驗

選擇大腸埃希菌做中和劑鑒定試驗。將大腸埃希菌制成含有機干擾物質的菌懸液(細菌濃度1×108CFU/mL)。試驗分6組，按2002版《消毒學技術規范》中和劑懸液定量鑒定試驗程序進行。試驗在常溫下，重復3次。

1.4 最低抑菌濃度(MIC)檢測

用微量肉湯稀釋法[2]檢測健之素的最小抑菌抑菌濃度。將健之素用營養肉湯做倍比系列稀釋后加入試驗孔(100μL/孔) 后，每孔加入細菌懸液10μL(細菌終5*104CFU/mL)。將相同濃度細菌接種于肉湯(100μL/孔)的培養基中為陽性對照。只含有等體積培養基的試驗孔為陰性對照。將已接種的微量稀釋盤置于(35+2)℃孵育箱孵育16-20h。為保持所有培養物的孵育溫度相同，重疊放置的微量稀釋盤不應超過4個。為防止干燥，應將稀釋盤用塑料袋密封。試驗在常溫下，重復3次。

1.5 最低殺菌濃度(MBC)檢測

采用瓊脂平板法檢測最小殺菌濃度。最小抑菌濃度檢測完后，取肉眼清亮實驗孔液體做平板劃線，每份樣液接種2個培養孔，結果取均值。置于(35±2)℃孵育箱孵育16-20h后計數各組平板上的菌落數。

1.6 懸液定量殺菌試驗

將細菌懸液和3%BSA等比例混合，制備含有機干擾物質的細菌懸液(細菌濃度為5×107/mL)，置20℃±1℃水浴中備用。實驗在48孔微孔板中進行。在已含有倍比稀釋健之素的微孔(400μL/孔)中，分別加入含有機干擾物質的細菌懸液(100μL/孔)作用不同時間(5min、10min、15min、20min、25min、30min)。取出混合液(50μL/孔)加入到已含中和劑(450μL/孔)的試驗孔中。作用10min后，每孔分別吸取100μL，接種培養平板每份樣液接種2個培養孔，結果取均值。同時，用無菌水代替消毒液作為陽性對照。用水代替碘伏和細菌的試驗孔為空白對照。試驗板置于(35+2)℃孵育箱孵育48h后觀察最終結果，計數各組菌落數(CFU/mL)。試驗在常溫下，重復3次。

2 結果

2.1 中和劑鑒定試驗

試驗結果以第1組無試驗菌生長，或僅有極少數試驗菌菌落生長，第2組有較第1組為多，但較第3、4、5(組)為少的試驗菌菌落生長，第3、4、5(組)有相似量試驗菌生長，其組間菌落數誤差率應不超過15%，第6組無菌生長為合格。含3%硫代硫酸鈉的中和劑，可有效中和健之素消毒劑對大腸埃希菌的殘留作用且中和劑和中和產物對試驗菌生長及培養基無影響，該中和劑對健之素2000mg/L合格(表1)。

表1 中和劑鑒定實驗結果

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

結果顯示，健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和陰溝腸桿菌的MIC均為 250mg /L。健之素對銅綠假單胞菌的MIC為125mg /L(圖1)。

圖1 健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌最小抑菌濃度 (MIC)結果

2.3 最低殺菌濃度(MBC)

肉眼觀察瓊脂平板的結果，結果如表2所示。健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和陰溝腸桿菌的MBC均為 250mg /L。健之素對銅綠假單胞菌的MBC為125mg /L。

表2 健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌最小殺菌濃度 (MBC)

2.4 健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌的殺滅作用

實驗結果：濃度250～2000mg/L的健之素對肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌分別作用5min～30min，菌落計數均為0 CFU/mL。濃度250～2000mg/L的健之素對大腸埃希菌作用5min～30min，500mg～2000mg/L的健之素可以完全殺滅大腸埃希菌，250mg健之素對大腸埃希菌的消毒效果隨著作用時間的延長殺滅率達到100%。結果如圖2所示。1000mg～2000mg/L的健之素可以完全殺滅陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌，250mg～500mg健之素對陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌的消毒效果隨著作用時間的延長殺滅率達到100%。結果如圖3和表3所示。

表3 不同濃度健之素對銅綠假單胞菌不同消毒作用時間后的細菌殺滅率(%)

圖2 不同濃度健之素對大腸埃希菌在不同的消毒作用時間后生長的菌落數(CFU/mL)

圖3 不同濃度健之素對陰溝腸桿菌不同消毒作用時間后生長的菌落數(CFU/mL)

3 討論

根據2018年全國細菌耐藥監測網統計，全國醫院革蘭陰性菌分離前五位的分別是：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌。它們在醫院環境長期存活，并在醫院內通過空氣、飛沫、醫護人員的手及各種醫療器械、輔助材料等傳播流行，甚至引起醫院內感染的暴發流行[3]。在醫學院校，這五種細菌作為腸桿菌科和非發酵菌屬的代表菌種，在《臨床微生物學檢驗》實驗課程中用于學生的實驗教學。在實驗中，會出現學生將菌種遺漏在桌面、地面或者個人防護用品上，如果沒有選擇合適的消毒劑進行消毒，菌種會被帶出實驗室，造成菌種泄露，嚴重者會影響師生生命。

健之素作為醫院常用的醫用消毒劑，其殺菌效果較好。健之素對不同的菌種有不同的消毒時間，而且其濃度隨著配置時間的延長逐漸降低。因此本研究健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌的殺菌效果，為實驗室的生物安全提供科學依據。

實驗結果表明，健之素對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為250mg/L。健之素對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為125mg/L。微孔板懸液定量殺滅實驗顯示，1000～2000mg/L健之素的消毒作用時間5min～30min，可以完全殺滅大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌。250～500mg/L健之素隨著消毒作用時間的延長(延長到30min)，可以完全殺滅大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌。因此，各實驗室可以使用濃度1000～2000mg/L健之素，消毒作用5min，對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌殺滅率達到100%，避免菌種泄露危害的發生，為實驗室生物安全提供保障。