腦震寧方對(duì)模型大鼠腦組織神經(jīng)元的保護(hù)作用*

趙樂(lè)，劉海霞，劉濤，竇殿奎，張晨曦，王超群，3，王永輝，王旭文

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619；2.山西振東生物制藥有限公司，晉中 030600；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065)

腦震蕩屬于原發(fā)性顱腦損傷中常見(jiàn)的輕度腦損傷，多見(jiàn)于交通意外、運(yùn)動(dòng)、軍隊(duì)訓(xùn)練、爆破等。患者在頭部受到劇烈撞擊后出現(xiàn)的意識(shí)障礙、記憶力缺失、及惡心、嘔吐等[1]在休息后可恢復(fù)，但部分患者會(huì)留有頭痛、眩暈、失眠[2-4]等后遺癥。腦震寧方于2017年入選首批“山西名藥”名錄，為行氣活血、養(yǎng)心安神的有效方劑。臨床研究證實(shí)，其對(duì)腦外傷和顱內(nèi)血腫等有確切療效，且對(duì)腦震蕩后出現(xiàn)的頭痛、頭暈、健忘、失眠等均有緩解作用[5]。本實(shí)驗(yàn)探討腦震寧方對(duì)腦震蕩神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)介質(zhì)的作用，為腦震蕩的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(170±10) g，64只，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，合格證號(hào)：11400700352037。實(shí)驗(yàn)通過(guò)山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，24 h晝夜節(jié)律光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥材與試劑 腦震寧顆粒(山西振東安特生物制藥有限公司，批號(hào)：201803)，吡拉西坦(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)：6180306)，甲苯胺藍(lán)染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1031A18)，Weil 髓鞘染色液(Bioswamp公司，批號(hào)：CY1710)，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(institute nacional de obras sanitarias，iNOS)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、白細(xì)胞介素6( IL-6)一抗(Bioswamp公司，批號(hào)：PAB43765，PAB40457，PAB32097，PAB40563)，二抗試劑盒(武漢博士德公司，批號(hào)：12L2B)，二氨基聯(lián)苯胺顯色劑(Bioswamp，批號(hào)：PAB180021)，Trizol(Ambion公司，批號(hào)：15596026)，YBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems公司，批號(hào)：KM4101)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，批號(hào)：639505)。

1.1.3儀器 組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)(泰維科技有限公司，TB-718D，TB-718L)，石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，RM2235)，恒溫烘箱(上海恒一科學(xué)儀器有限公司，DHG-9023A)，正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，DM1000)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取54只大鼠，采用金屬單擺閉合式[6-7]擊打大鼠腦顳部，角度70 °，制備單純性腦震蕩大鼠模型，同時(shí)滿足下列條件者納入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停孩俅笫笫茏矒艉蠹纯坛霈F(xiàn)一過(guò)性呼吸頻率減慢或暫停，但不超過(guò)20 s逐漸恢復(fù)呼吸節(jié)律；②翻正反射消失，但不超過(guò)3 min，恢復(fù)后無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙。

1.2.2分組及給藥 將造模成功的50只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，依次為模型對(duì)照組，吡拉西坦組和腦震寧小、中、大劑量組，每組10只。造模24 h后，各組大鼠分別灌服相應(yīng)藥物，劑量(根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)大鼠和人體給藥體表面積公式換算)分別為：腦震寧大、中、小劑量組10.0，5.0，2.5 g·kg-1，吡拉西坦組0.324 g·kg-1，每天1次。另取正常大鼠10只作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠分別灌胃等體積純化水，均連續(xù)21 d。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

(1)一般狀態(tài)觀察。每日觀察大鼠自主活動(dòng)行為，攝食量、飲水量、皮膚毛色變化等。

(2)取材。末次給藥24 h后，麻醉大鼠處死后，冰盤(pán)中開(kāi)顱取腦組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片后待染色。

(3)Weil氏染色觀察髓鞘分布。對(duì)空白切片組織行常規(guī)Weil氏染色，顯微鏡下觀察大腦胼胝體、腦干、小腦白質(zhì)等部位神經(jīng)髓鞘排列。

(4)甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)尼氏體表達(dá)。常規(guī)甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下觀察腦組織內(nèi)尼氏體表達(dá)，并利用Image-6.0對(duì)尼氏體平均吸光度進(jìn)行分析。

(5)免疫組化檢測(cè)腦組織iNOS、IL-6、GFAP和MMP-9蛋白表達(dá)。對(duì)切片組織進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色后(一抗?jié)舛染鶠?：300)，顯微鏡下觀察并分析組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)。

(6)RT-PCR檢測(cè)腦組織細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、IL-6和MMP-9 mRNA表達(dá)。對(duì)腦組織海馬取材后，依次進(jìn)行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增，以2-△△CT法計(jì)算各指標(biāo)的mRNA表達(dá)。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，10 min；60 ℃，60 s；72 ℃，5 min；40個(gè)循環(huán)。β-actin為內(nèi)參，IL-6、ERK和MMP-9引物序列見(jiàn)表1。

表1 ERK、IL-6和MMP-9 引物序列Tab.1 Primer sequences of ERK，IL-6 and MMP-9

2 結(jié)果

2.1腦震寧方對(duì)腦震蕩模型一般狀況的影響 實(shí)驗(yàn)期間，模型對(duì)照組大鼠精神躁狂，警惕性增強(qiáng)，被毛萎黃臟亂，攝食減少；各給藥組大鼠隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)狂躁表現(xiàn)逐漸改善，攝食逐漸增加。

正常對(duì)照組大鼠各部位神經(jīng)髓鞘排列整齊，無(wú)斷裂、彎曲腫脹等現(xiàn)象；模型對(duì)照組神經(jīng)髓鞘排列紊亂，甚至彎曲腫脹、變形或斷裂；各治療組大鼠髓鞘彎曲腫脹減輕，其中吡拉西坦組和腦震寧中、大劑量組大鼠神經(jīng)髓鞘破壞恢復(fù)程度較好，見(jiàn)圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖1 6組大鼠腦組織神經(jīng)髓鞘排列(Weil氏染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.1 Arrangement of nerve myelin sheath in brain tissues of six groups of rats(Weil stain，×200)

2.2腦震寧方對(duì)腦震蕩模型腦組織內(nèi)尼氏體表達(dá)(吸光度)的影響 正常對(duì)照組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體深藍(lán)色；模型對(duì)照組較正常對(duì)照組神經(jīng)元尼氏體顯著減少(P<0.05)，且染色淡淺；各治療組大鼠神經(jīng)元尼氏體染色加深，與模型對(duì)照組比較，吡拉西坦組和腦震寧小、中劑量組尼氏體顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表2和圖2。

表2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(dá)(吸光度)Tab.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.3腦震寧方對(duì)腦震蕩模型腦組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的影響 見(jiàn)圖3，GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)淡黃或棕黃色，iNOS和IL-6主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，MMP-9主要分布在細(xì)胞膜上，GFAP在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均有分布。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組腦組織GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，各治療組GFAP、iNOS表達(dá)顯著降低(P<0.05)，同時(shí)，除腦震寧中劑量組外，各用藥組IL-6、MMP-9表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS和MMP-9的表達(dá)(吸光度)Tab.3 Expressions of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.4腦震寧方對(duì)腦震蕩模型海馬ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，各治療組IL-6表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，同時(shí)，吡拉西坦組和腦震寧中劑量組ERK、MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 6組大鼠腦組織ERK、IL-6和MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)Tab.4 Relative expression of ERK，IL-6 and MMP-9 mRNA in brain tissues of six groups of rats

3 討論

腦震蕩臨床常表現(xiàn)為一過(guò)性眩暈、昏迷、記憶缺失，未見(jiàn)腦部影像學(xué)異常，導(dǎo)致其在臨床診治中未予以足夠重視。現(xiàn)代病理學(xué)研究認(rèn)為，其發(fā)生伴隨腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷。神經(jīng)元及其軸突是神經(jīng)信號(hào)形成和信息傳遞的重要環(huán)節(jié)，腦震蕩發(fā)生后如未及時(shí)救治，出現(xiàn)腦組織缺血缺氧以及炎癥反應(yīng)等，造成腦組織充血以及細(xì)胞變性和壞死等為主的神經(jīng)元損傷[8]，發(fā)生情感和認(rèn)知障礙等[9]。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(dá)(甲苯胺藍(lán)染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(toluidine blue staining，×200)

腦震寧方中地黃和當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血，丹參、丹皮和川芎行氣活血化瘀，酸棗仁、柏子仁安神養(yǎng)血寧心，佐以陳皮、茯苓和竹茹和胃止嘔，全方共奏行氣活血、養(yǎng)血安神、降逆止嘔之功。研究認(rèn)為，活血化瘀法有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)神經(jīng)血管單元的功能[10]。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞中少突膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元髓鞘形成細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)起支撐和營(yíng)養(yǎng)作用。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的免疫細(xì)胞，可調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)免疫炎癥因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表達(dá)，調(diào)節(jié)腦內(nèi)環(huán)境及神經(jīng)細(xì)胞功能。GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞的骨架組成蛋白[11]，GFAP過(guò)度分泌會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成，影響神經(jīng)細(xì)胞的再生。MMP-9具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[12]。實(shí)驗(yàn)表明，腦震蕩后大鼠腦組織GFAP和MMP-9表達(dá)升高，且病理研究顯示，腦組織髓鞘存在明顯腫脹、排列紊亂，以及尼氏體數(shù)量減少，說(shuō)明腦震蕩發(fā)生時(shí)存在神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的異常；腦震寧方可下調(diào)模型大鼠神經(jīng)元GFAP和MMP-9表達(dá)，改善髓鞘腫脹以及尼氏體數(shù)量減少的神經(jīng)損傷性病理變化，說(shuō)明腦震寧方對(duì)腦震蕩后腦組織神經(jīng)元損傷修復(fù)和促進(jìn)再生具有良性調(diào)節(jié)作用。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS、MMP-9細(xì)胞陽(yáng)性的表達(dá)(×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.3 Expression of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats( ×200)

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞不僅參與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)組成，二者還相互耦聯(lián)，參與腦組織內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。在腦組織發(fā)生缺血缺氧、感染或創(chuàng)傷時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，其分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，以支持髓鞘蛋白合成，維護(hù)神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用被抑制；小膠質(zhì)細(xì)胞則極化為具有刺激炎癥反應(yīng)的M1型細(xì)胞，造成神經(jīng)元的功能異常和結(jié)構(gòu)損傷[13]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activeated protein kinase，MAPK)與炎癥反應(yīng)等關(guān)系密切，ERK1/2通路是MAPK信號(hào)通路的主要組成通路之一。研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)可激活MAPK通路，并參與神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]；同時(shí)，激活p38MAPK可直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞中的iNOS和腫瘤壞死因子(TNF)-α等，導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥。整合藥理學(xué)研究認(rèn)為，MAPK通路為腦震寧干預(yù)腦震蕩的主要信號(hào)通路[15]，本課題組研究也發(fā)現(xiàn)，腦震蕩模型ERK表達(dá)異常升高，同時(shí)，腦組織內(nèi)IL-6、iNOS表達(dá)也顯著升高。IL-6是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其通過(guò)β鏈向腦組織各類(lèi)細(xì)胞傳遞信息，誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，參與腦組織炎癥反應(yīng)[16]；iNOS在顱腦損傷過(guò)程中的高表達(dá)，使其與氧自由基結(jié)合生成強(qiáng)氧化劑，氧自由基清除物質(zhì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶等降低[17]，造成氧化損傷性神經(jīng)毒性，在加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，造成神經(jīng)細(xì)胞腫脹和死亡[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，ERK激活是MMP-9活化和過(guò)度表達(dá)的必要條件，且已證實(shí)抑制ERK對(duì)下調(diào)MMP-9表達(dá)有很好的作用，MAPK抑制劑P38可明顯減少M(fèi)MP-9表達(dá)[19]。結(jié)合MAPK對(duì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用，提示神經(jīng)MAPK通路可能通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)參與神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。腦震寧方干預(yù)后，腦組織ERK及IL-6、iNOS均受到抑制，結(jié)合活血化瘀、養(yǎng)血之功效對(duì)抗炎及修復(fù)腦神經(jīng)損傷的作用，提示腦震寧方對(duì)腦組織神經(jīng)元的修復(fù)作用與其調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，腦震蕩發(fā)生可能通過(guò)ERK通路參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度增生、腫脹等。腦震寧方可抑制IL-6、iNOS及MMP-9、GFAP的表達(dá)，從而起到修復(fù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的作用。腦震寧中劑量組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大劑量組較小劑量組的變化幅度更小，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腦震寧劑量以中劑量組為佳；但是，各劑量組中，IL-6和MMP-9蛋白和基因相對(duì)表達(dá)量未完全一致，反映腦震寧方對(duì)腦震蕩的作用存在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的不同步性，今后可進(jìn)一步進(jìn)行免疫印跡分析，對(duì)蛋白和蛋白磷酸化進(jìn)行定量，從功能激活角度對(duì)腦震寧方的有效劑量進(jìn)行深入探索。