甲氟喹對急性癲癇小鼠認知功能的影響研究

倪紅 鄭卜真 王恩 柯紹發 王皖芬 馬傳花 羅莎

癲癇是一種常見的神經系統慢性疾病。臨床上30%～40%的癲癇患者存在認知功能障礙，這對其生活、工作等均有較大的影響。此外，臨床常用的傳統抗癲癇藥物雖然能有效控制70%～80%的癲癇發作，但會加劇患者認知功能減退。N-甲基D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體是中樞神經系統中主要的興奮性氨基酸受體，其過度激活可導致癲癇，而癲癇發作后又可引起細胞膜內外離子失衡，激活神經毒性信號傳導途徑，產生神經毒性效應，導致神經元損傷或死亡，從而造成一系列神經元功能障礙。NMDA受體的適當激活與學習、記憶、認知過程的形成有關。Stafstrom等[1]利用致癇模型研究發現NMDA受體過度興奮導致的發育期大鼠反復癲癇發作后，其成年期認知功能存在損傷，遠期神經興奮性發生改變。Thompson等[2]研究發現，NMDA受體激活后繼發的內向電流系Pannx1通道開放所致，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發作。甲氟喹是一種Pannx1通道阻滯劑，目前主要用于瘧疾的治療。Pinheiro等[3]研究發現，甲氟喹可抑制KA小鼠癲癇自發發作的頻率和總時間。因此，本研究就甲氟喹對急性癲癇小鼠認知功能的影響作一探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康黃色熒光蛋白轉基因C57 Thy1-YFP小鼠30只，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。其中雄性16只，雌性14只；出生后15～17 d；體重（15.0±0.5）g。本實驗通過動物倫理委員會倫理審查，全程遵守實驗中心動物管理條例。

1.2 動物分組與處理 按隨機數字表法分為癲癇組、甲氟喹組和對照組，每組10只。甲氟喹組在建模前1 h按20ml/kg的劑量腹腔注射甲氟喹注射液（規格：25mg/片，批號：53230-10-7，深圳海思安生物技術有限公司；將25 mg甲氟喹溶于25 ml 0.9%氯化鈉溶液中配成1 g/L的甲氟喹注射液）[4]；癲癇組、對照組按20 ml/kg的劑量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。建模：癲癇組、甲氟喹組小鼠按3 ml/kg的劑量腹腔注射東莨菪堿注射液（規格：1 g/ml，批號：YRD059，成都儀睿生物科技有限公司；將2 mg東莨菪堿溶于10 ml的0.01 mol PBS中配成 0.2 g/L的東莨菪堿注射液），30 min后按15 ml/kg的劑量腹腔注射匹魯卡品注射液（規格：5 g/瓶，批號：CAS 54-71-7，北京Med Chem Express生物科技公司；將0.57 g匹魯卡品溶于20 ml 0.9%氯化鈉溶液中配成28.5 g/L的匹魯卡品注射液），誘發Ⅴ級癲癇發作持續1 h為建模成功。若注射后未誘發Ⅲ級以上癲癇發作，可重復給予原劑量匹魯卡品注射液，以5次為最高限。癲癇發作分級標準：參照Racine分級標準。無驚厥為0級；面部陣攣為Ⅰ級；面部陣攣+節律點頭為Ⅱ級；面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣為Ⅲ級；面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立為Ⅳ級；面部陣攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒為Ⅴ級。

1.3 小鼠認知功能測定 使用Morris水迷宮系統（包括水迷宮、電腦攝像系統及配套軟件分析系統；購自上海移碼數字有限公司）；水迷宮是一個直徑96 cm、高 50 cm的圓柱形水池，池中水深 40 cm、水溫（21.0±1.5）℃。（1）空間學習能力測定：采用定位航行試驗。迷宮共分成4個象限，在距水面下1 cm處放置在一個固定的水下平臺。所有小鼠接受連續5 d訓練[5]，每天進行4次空間習得實驗，每次訓練間隔時間60 min，記錄其尋找到水下平臺的時間，即逃避潛伏期。若60 s內找到水下平臺，逃避潛伏期為小鼠找到水下平臺的時間；若未在規定時間內找到平臺，則將小鼠輕輕引導至水下平臺停留10 s，逃避潛伏期為60 s。（2）記憶能力測定：采用空間探索試驗。第6天撤走水下平臺，任選一個入水點將小鼠放入水池中，使用水迷宮軟件記錄其在60 s內的游泳軌跡，記錄小鼠穿越平臺次數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料符合正態分布的以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布的以 M（P25，P75）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠5 d內逃避潛伏期比較 第1天癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組（均P＜0.05），而癲癇組與甲氟喹組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；第2～5天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組（均P＜0.05），但甲氟喹組均短于癲癇組（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠5 d內逃避潛伏期比較（s）

2.2 3組小鼠穿越平臺次數比較 癲癇組、甲氟喹組小鼠第6天穿越平臺次數均明顯少于對照組（均P＜0.05），但甲氟喹組多于癲癇組（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組小鼠穿越平臺次數比較（與對照組比較，*P＜0.05；與癲癇組比較，△P＜0.05）

3 討論

NMDA受體是中樞神經系統中主要的興奮性氨基酸受體，在全腦都有分布，以海馬、大腦皮質、紋狀體、杏仁體中的含量最高[6]。NMDA參與學習、記憶、癲癇、藥物依賴成癮及神經系統退行性疾病等多種病理生理過程。NMDA是調節神經元興奮性的關鍵，NMDA受體離子通道的超極化激活環磷酸腺苷門控通道，導致神經興奮性增加，從而發生癲癇，甚至癲癇持續狀態[7]，而癲癇發作后又可導致NMDA受體過度激活，引起細胞膜內外離子失衡，激活神經毒性信號傳導途徑，產生神經毒性效應，使得神經元損傷或死亡，最終導致認知功能嚴重受損。Inostroza等[8]研究發現氯化鋰-匹魯卡品癲癇大鼠的空間學習及記憶獲得及維持能力均明顯受損。但NMDA受體的適當激活有助于提高學習及記憶能力。NMDA受體在重復或長時間激活產生的NMDA通道后存在一個繼發的內向電流，即使洗脫NMDA，該內向電流依然存在。這一現象目前一直未得到合理解釋。Thompson等[2]在急性分離的海馬錐體神經元實驗中發現，NMDAR受體激活后繼發的內向電流系Panx1通道開放所致。Burma等[4]研究發現Pannx1通道抑制劑能產生類似抑制癲癇發作的作用。Silverman等[9]研究發現甲氟喹是Pannx1通道的良好阻滯劑。Velasquez等[10]研究發現甲氟喹能明顯抑制癲癇發作。既往研究顯示，NMDA受體在癲癇發作與學習、記憶等認知功能中均有重要作用，適當抑制NMDA受體活性也可以提高“致癇閾”，減少癲癇的發作頻率；同時能保護神經元功能，也有利于防止癲癇患者認知功能的下降[11-12]。本實驗使用甲氟喹阻斷Panx1通道，以觀察小鼠癲癇發作時谷氨酸能神經元的異常電活動對認知功能的影響，如影響變小或有改善作用，此通道或將成為抗癲癇藥物治療的重要靶點。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于1981年設計并應用于研究大腦學習記憶機制的一種實驗手段[13]，它主要用于評估空間學習和記憶能力[14-15]。隨著實驗的不斷改良，Morris水迷宮被認為是一種穩健、可靠的測試[16]。經典的Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分，一般認為小鼠的標準訓練周期為5 d[17-19]。最近一項研究報道，海馬區膽堿能神經元活動在訓練早期顯著增加[20]。Stafstrom等[1]對NMDA致癇模型大鼠進行水迷宮試驗，結果發現在出生后85 d的大鼠中，NMDA致癇組逃避潛伏期明顯長于對照組，提示NMDA對大腦發育期的大鼠致癇后，會導致其成年期空間記憶能力下降。在前期研究中，筆者發現甲氟喹能抑制癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經元的興奮性[21]。故本實驗以甲氟喹阻斷NMDA受體內向電流為切入點，采用Morris水迷宮實驗來研究甲氟喹對急性癲癇發作小鼠空間學習及記憶能力的影響。本研究結果顯示，定位航行試驗第1天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組，而癲癇組與甲氟喹組比較差異無統計學意義；第2～5天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組，但甲氟喹組均短于癲癇組。第6天空間探索試驗中，癲癇組、甲氟喹組小鼠穿越平臺次數均明顯少于對照組，但甲氟喹組多于癲癇組。這說明癲癇發作后小鼠空間學習及記憶能力較正常小鼠均有所下降；而甲氟喹干預能使急性癲癇發作小鼠的空間學習及記憶能力均有所改善。

綜上所述，甲氟喹控制小鼠癲癇發作的同時，還能改善其空間學習及記憶能力，顯著提高癲癇小鼠的認知功能。然而，亦有研究證實在少數瘧疾患者中應用甲氟喹，可誘發癲癇發作[22-23]。由于甲氟喹作用于不同的靶點（如神經元、星形細胞、鈉通道或內質網蛋白），可表現出多種不同的不良反應[24]，這也導致其用于癲癇治療仍存在明顯的局限性。未來希望涌現出具有高選擇性的Panx1通道阻滯劑，在做到控制急性癲癇的同時，又能減少對患者認知功能的影響。