大蒜素在替莫唑胺誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥中的作用及其機(jī)制研究

陳景南 王承 杜杭根

膠質(zhì)瘤是一種常見的腦腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%[1]。近年來雖然治療技術(shù)有了很大的提高，但整體療效始終欠佳，因而迫切需要探索新的有效療法[2]。臨床實(shí)踐表明，替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種DNA烷基化抗腫瘤藥，能起到延緩腫瘤進(jìn)展、延長患者生存期等作用，目前是用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一線治療藥物。但是最近研究表明，TMZ的治療效能因腫瘤的化學(xué)耐藥性而受到限制，這已成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要障礙[3-4]。因此，研究TMZ耐藥的潛在機(jī)制迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要生物活性成分，已有多項(xiàng)研究證明其對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。在前期研究中，筆者同樣發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抗膠質(zhì)瘤的作用。然而，大蒜素能否促進(jìn)TMZ耐藥的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)TMZ的化療敏感性，目前尚未見報(bào)道。本研究選取TMZ耐藥的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87/TMZ作為研究對象，探討大蒜素在TMZ誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥中的作用及其機(jī)制，為大蒜素更好地應(yīng)用于臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 TMZ耐藥腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87/TMZ、FBS（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司）；大蒜素、抑制劑 LY294002(美國 Sigma公司)；TMZ(規(guī)格：100 mg，批號：H20130603，濟(jì)寧泰諾化工有限公司)；抗磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-AKT）抗體、抗蛋白激酶（protein kinase，AKT）抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）1抗體、TIMP2抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗體、MMP-9 抗體（美國Cell Signaling公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 體外培養(yǎng)U87/TMZ，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后隨機(jī)分為4組，分別加入0、10、25、50 mg/L的大蒜素，置于含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并檢測磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 相關(guān)蛋白表達(dá)、TIMP1及MMP-2等相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率；加入50 μM抑制劑LY294002處理細(xì)胞1 h，收集細(xì)胞并檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。（1）PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：收集上述4組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，在4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，即蛋白質(zhì)樣品。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)含量。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。轉(zhuǎn)移后，膜在封閉溶液中孵育，加入抗p-AKT抗體，4℃孵育過夜，次日洗滌后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h后再次洗滌5 min×3次，于暗室發(fā)光。以AKT為內(nèi)參對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。（2）TIMP1、MMP-2等相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：大蒜素25 mg/L處理24 h后收集細(xì)胞，其余操作同上述步驟；其中加入的抗體為抗MMP-2抗體（1:500）、抗 MMP-9抗體（1:500）、抗 TIMP1抗體（1:500）、抗 TIMP2抗體（1:500），內(nèi)參對照為GAPDH。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測 采用MTT法。將細(xì)胞接種于96孔板，孵育過夜，次日加入10、25、50 mg/L大蒜素，5% CO2、37 ℃孵育 24 h，加入 20 μl MTT 溶液（濃度為5 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄液，PBS沖洗2～3次，再加入含MTT的培養(yǎng)液。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，置搖床上低速震蕩約10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測量吸光度值。以二甲基亞砜處理的細(xì)胞作為對照，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。不同濃度大蒜素處理細(xì)胞后PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率比較采用單因素方差分析；0、25 mg/L大蒜素處理細(xì)胞后TIMP1、MMP-2等相關(guān)蛋白表達(dá)量比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；LY294002阻斷前后細(xì)胞凋亡率比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度大蒜素處理細(xì)胞后PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 隨著大蒜素濃度的增加，p-AKT蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度大蒜素處理細(xì)胞后磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/抗蛋白激酶（AKT）相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖（p-AKT為磷酸化AKT）

2.2 0、25 mg/L大蒜素處理細(xì)胞后TIMP1、MMP-2等相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 與0 mg/L組比較，25 mg/L組TIMP1、TIMP2蛋白表達(dá)量均明顯增加（均P＜0.05），而MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

圖2 0、25 mg/L大蒜素處理細(xì)胞后抗基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）1、抗基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2等相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（與0 mg/L組比較，*P＜0.05）

2.3 LY294002阻斷前后細(xì)胞凋亡率比較 與阻斷前相比，10、25、50 mg/L 組加入抑制劑 LY294002 阻斷后，細(xì)胞凋亡率均明顯升高（均P＜0.05）；隨大蒜素濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 LY294002阻斷前后細(xì)胞凋亡率比較（與阻斷前比較，*P＜0.05）

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是目前最常見的一種原發(fā)性腦腫瘤，大多數(shù)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有高度增殖性和浸潤性，因而治愈率通常較低[5-6]。另外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不容樂觀，中位總生存期約為12個(gè)月[7]。目前膠質(zhì)瘤的主要治療手段是手術(shù)切除，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤難以通過手術(shù)完全切除。盡管TMZ、順鉑等化療藥物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有抗腫瘤作用，但由于其固有性和獲得性耐藥，大多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者對化療的反應(yīng)較差。因此，如何增強(qiáng)對TMZ的敏感性是研究重點(diǎn)。大蒜素具有明顯的抗癌功效，可作為各種腫瘤（如胃癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等）的一線化療藥物[8]，故本實(shí)驗(yàn)擬研究大蒜素在TMZ誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥中的作用及其機(jī)制。

PI3K/AKT信號通路是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲的關(guān)鍵調(diào)控途徑。近來研究表明，可能與程序性死亡受體1可以優(yōu)先與多種PI3K/AKT信號傳導(dǎo)蛋白結(jié)合有關(guān)，其可導(dǎo)致細(xì)胞侵襲的促進(jìn)和免疫應(yīng)答的抑制[9]。關(guān)于PI3K/AKT信號通路對TMZ敏感性的影響，Huang等[10]認(rèn)為激活的PI3K/AKT信號通路是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中miR-223/PAX6介導(dǎo)的TMZ敏感性降低的原因。據(jù)報(bào)道，抑制PI3K/AKT信號通路后，TMZ敏感性也得到增強(qiáng)[11]。本研究結(jié)果顯示，加入大蒜素后，U87/TMZ細(xì)胞中PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路活化情況明顯減弱，且隨著大蒜素濃度的增加而逐漸降低，這表明TMZ耐藥與PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路活化有關(guān)，而大蒜素的作用在于降低其活化性，從而提高TMZ治療膠質(zhì)瘤的療效，增強(qiáng)其敏感性。另外，本研究加入PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路的抑制劑LY294002后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，也說明PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路與TMZ耐藥密切相關(guān)。

腦膠質(zhì)瘤侵襲是一個(gè)復(fù)雜的病理、生理過程，與多個(gè)基因的改變密切相關(guān)。MMP是一個(gè)肽鏈內(nèi)切酶家族，依賴Zn2+發(fā)揮作用，主要在細(xì)胞外基質(zhì)中起降解作用，破壞腫瘤細(xì)胞的組織學(xué)屏障。MMP-2、MMP-9是一種膠原酶，是MMP家族中的主要成員，參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生、抑制細(xì)胞凋亡等過程。因此，MMP-2和MMP-9被認(rèn)為是開發(fā)抗癌藥物的重要靶標(biāo)。TIMP是由TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4組成的哺乳動(dòng)物蛋白家族，它們共同顯示廣泛的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性。據(jù)報(bào)道，TIMP是天然的MMP抑制劑，可通過取消金屬蛋白酶家族所有活化成員的水解活性來防止細(xì)胞外基質(zhì)的降解[12-13]。MMP和TIMP的異常表達(dá)可能會(huì)影響基質(zhì)蛋白的重構(gòu)、形成和降解，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲。本實(shí)驗(yàn)在耐藥細(xì)胞中加入大蒜素后，TIMP1、TIMP2蛋白表達(dá)量均明顯增加，而MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均明顯減少，這表明MMP和TIMP之間具有平衡性，并且大蒜素具有改變TIMP/MMP平衡的作用。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的耐藥與PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路活化有關(guān)，而大蒜素能夠提高TMZ治療腦膠質(zhì)瘤的療效，增強(qiáng)TMZ的敏感性，其作用機(jī)制是通過阻斷 PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路，上調(diào)TIMP1、TIMP2表達(dá)并下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)，從而改變TIMP/MMP平衡，發(fā)揮治療作用。這為臨床耐TMZ的腦膠質(zhì)瘤患者化療藥物的篩選提供了新的思路，并為大蒜素用于臨床治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。