基于網絡藥理學研究塞來昔布治療腺性膀胱炎的分子機制

樸松哲 陳靜 洪濤 陳超前 周高波 柯莽

腺性膀胱炎（cystitis glandularis，CG）是一種以膀胱黏膜和下尿路上皮的腺上皮化生為特征的良性膀胱炎癥性病變，發病率為0.9%～1.9%[1]，臨床表現主要有膀胱刺激征、血尿、會陰部不適、性交痛等，較難治愈，易復發。因此，繼續探索治療CG的更有效方法十分必要。研究發現，慢性膀胱炎癥刺激是腺性膀胱炎的病因之一[2-3]。近年來有學者發現CG患者行膀胱電切術后給予選擇性環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑塞來昔布治療后病情得到有效控制，且免疫組化染色結果提示COX-2蛋白在CG組織中表達呈陽性[4-5]。該研究結果為探尋治愈CG的有效方法提供了新的方向。但是，目前關于塞來昔布治療CG的分子機制尚不清楚。因此，本研究基于網絡藥理學方法對塞來昔布治療CG的作用靶點及可能的分子機制作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 塞來昔布作用靶點分析 利用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取塞來昔布（美國輝瑞公司，C17H14F3N3O2S）3D結構和簡化分子現行輸入規范表達式（simplified molecular input line entry specification，SMILES）（CC1=CC=C（C=C1（C2=CC（=NN2C3=CC=C（C=C3）S（=O）（=O）N）C（F）（F）F），導入Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget prediction.ch）數據庫，獲取藥物靶點。將藥物靶點導入UniProt（http://www.uniprot.org）數據庫，物種限定為人，將所有基因名校對為官方名稱（official symbol）。

1.2 CG相關基因分析 分別利用GeneCards（http://www.genecard.org）數據庫[6]和 CTD（http://ctdbase.org）數據庫[7]查詢與CG相關聯的基因集合。

1.3 塞來昔布治療CG靶點預測 將塞來昔布作用靶點基因集合與CG相關聯的基因集合取交集，并繪制Venn圖取交集，篩選塞來昔布治療CG可能的潛在靶點。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建 將上述基因集輸入GENEMANIA（http://genemania.org/）數據庫[8]構建 PPI網絡。

1.5 富集分析 通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫[9]，設定物種為人，閾值為P＜0.05、偽發現率≤0.05，對上述基因集功能進行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encycopedia of genes and genomes，KEGG） 信號通路富集分析。運用R 3.6.0軟件ggplot2程序包繪制氣泡圖。

1.6 分子對接 利用PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb/）獲取相應靶點的人源蛋白三維結構；利用ZINC數據庫獲取配體塞來昔布分子結構；參考Bikadi等[10]的分子對接方法評估塞來昔布與CG潛在靶點的結合能，結合能＜0 kJ/mol表示配體與受體能夠自發結合，且該值越小表示結合能力越高。

2 結果

2.1 塞來昔布治療CG靶點分析結果 利用GeneCards、CTD數據庫查詢到與CG有關的靶點分別為253、21 964個，共篩選出塞來昔布治療CG潛在靶點共8個，即 PTGS1、PTGS2、MAPK14、CCND1、HRH1、PARP1、CDK1和 RAF1，見圖1（插頁）。

圖1 塞來昔布靶基因與腺性膀胱炎（CG）相關基因的Venn圖

2.2 PPI網絡 利用GENEMANIA數據庫導入上述8個基因構建PPI網絡，發現塞來昔布治療CG潛在治療靶點以及與其直接或減價作用的靶點共28個，靶點之間相互聯系達5種，見圖2（插頁）。

圖2 GENEMANIA數據庫構建塞來昔布治療腺性膀胱炎（CG）作用基因集合的蛋白相互作用（PPI）網絡

2.3 GO富集分析和KEGG信號通路富集分析 GO富集分析發現，塞來昔布治療CG的靶點分別富集在后隨鏈伸長、DNA修復、細胞分裂等生物學過程，細胞核、核漿、細胞質等細胞組分，DNA連接酶活性、蛋白激酶結合、NAD+ADP核糖轉移酶活性等分子功能中；KEGG信號通路富集分析發現，該基因集主要富集在堿基切除修復、催產素信號通路、血管內皮生長因子信號通路等信號通路上，見圖3（插頁）。

圖3 塞來昔布治療腺性膀胱炎（CG）靶基因集合的基因本體論（GO）富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

2.4 分子對接結果 分子對接結果顯示，塞來昔布與潛在靶點均有較好的結合能力。除PTGS2（COX-2）外，塞來昔布與CDK1的結合能力最高，與PTGS1的結合能力最低，見圖4（插頁）和表1。

圖4 塞來昔布與靶點分子對接（a：PTGS1；b：MAPK14；c：CCND1；d：HRH1；e：PARP1；f：CDK1；g：RAF1）

表1 塞來昔布與腺性膀胱炎（CG）潛在靶點的結合能（kJ/mol）

3 討論

目前CG治療尚無統一的方案。一種觀點主張保守治療，另一種觀點則認為CG為癌前病變，主張予以電灼/電切術+化療藥物膀胱灌注[11]。近年來研究發現，COX-2在CG組織中高表達[12-14]。最近研究發現，CG患者行膀胱電切術后口服COX-2抑制劑塞來昔布后病情得到有效控制，且免疫組化染色發現COX-2蛋白在CG組織中表達呈陽性[4-5]。根據上述研究結果推測，COX-2異常表達可能與CG發生、發展有關，COX-2抑制劑有望成為治療CG的新策略。

本課題組通過網絡藥理學和生物信息學分析發現，PTGS1、PTGS2、MAPK14、CCND1、HRH1、PARP1、CDK1和RAF1等8個基因是塞來昔布治療CG的潛在作用靶點。PTGS1、PTGS2是催化花生四烯酸轉化為前列腺素類、血栓烷類的關鍵酶，PG產物在炎癥、疼痛和血小板聚集等方面起著重要作用。有研究發現CG組織中COX-2表達較正常膀胱組織增高，其中復發患者的 COX-2 表達顯著增高[15]。MAPK14（p38α）是 4 個p38 MAPKs之一，p38 MAPKs在在由促炎細胞因子或物理刺激等細胞外刺激所引發的細胞級聯反應中起重要作用，p38α和TNF-α表達上調與尿路上皮細胞凋亡有關[16]。CCND1基因編碼細胞周期蛋白Cyclin D1，可抑制細胞從G1期向S期轉換。人膀胱平滑肌細胞內CCND1可在LPS刺激下經NF-κB信號表達上調，進而促進細胞增殖和細胞外基質沉積，與慢性膀胱炎引起膀胱組織重建有關[17]。CG組織中CNND1表達較正常膀胱組織增高[17]。HRH1作為組胺最主要的受體壓型，廣泛分布于中樞和外周神經末梢，參與炎癥反應、疼痛反應、血管調節和肥胖等生理過程的調節[18]。此外，組胺通過HRH1直接增強COX-2的表達和功能，從而上調PGI2、PGE2水平[19]。PARP1是PARP家族中最主要成員，在氧化應激誘導DNA損傷時被激活，消耗大量NAD，繼而消耗ATP，導致細胞壞死；這說明抑制PARP1可通過減少細胞DNA損傷，從而對組織發揮保護作用[20]。研究發現，PARP-1在體內外均能與COX-2啟動子區抑制元件-655/-632結合，與COX-2呈負相關，在調控COX-2表達中發揮重要作用[21]。CDK1主要與Cyclin A和Cycling B結合，進而調控細胞周期[22]。RAF1是Raf激酶家族成員之一，RAS/RAF/MAPK信號通路是多種刺激誘導COX-2轉錄的必要信號通路，與細胞生存有關[23]。該結果提示塞來昔布可能通過多靶點治療CG。GO富集分析發現，塞來昔布治療CG的預測靶基因集合分別富集在前列腺素內過氧合酶活性、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、蛋白激酶結合等分子功能上和蛋白質定位、細胞對化學刺激的反應、磷酸鹽代謝等生物學過程中。KEGG富集分析發現，該基因集合主要富集在細胞衰老、VEGF信號通路、內分泌抵抗等信號通路中。分子對接結果驗證塞來昔布與其治療CG的潛在靶點均有較好的結合。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析結合文獻復習篩選出塞來昔布治療CG潛在靶點共8個，這為進一步探索塞來昔布治療CG的作用機制提供了理論依據。